Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
При цитохимических исследованиях приходится считаться с тем, что химические фиксаторы могут вызывать артефакты,, т. е. изменения в клетках, вызванные тем или иным фактором. Чтобы избежать этого, используют метод высушивания замороженных объектов, в процессе которого химические компоненты клетки не осаждаются. Кусочки ткани толщиной около 0,1—1 мм и площадью 1 мм2 замораживают в изопентане, охлаждаемом жидким азотом до минус 170 °С. Замороженный объект переносят в сушильный аппарат, где при низкой температуре (минус 30—40 °С) в вакууме из него удал'яют воду. Высушенной материал затем готовят для микроскопического исследования. В нем хорошо сохраняются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, некоторые полисахариды и другие соединения
и не происходит нежелательного перераспределения вещества.
Дифференциальное центрифугирование приме» няют для изучения химического состава ядер, митохондрий и дру-. гих структур. В этом случае объект измельчают с использованием сахарозы в специальном приборе — гомогенизаторе. Полученный гомогенат путем дробного центрифугирования разделяют по плотности на фракции, состоящие из определенных, но изолированных клеточных структур. При сравнительно небольших ускорениях на центрифуге из гомогената осаждают клеточные ядра. При значительно больших ускорениях центрифугированием надосадочной жидкости выделяют митохондрии, а затем рибосомы и другие структуры.
Метод авторадиографии применяют для изучения локализации и синтеза нуклеиновых кислот в клеточных структурах с использованием меченых соединений и определения продолжительности митотического цикла. При работе этим методом используют изотопы, при распаде которых образуются электроны с малым запасом энергии.
Для регистрации а- и ^-излучений необходимы специальные фотоэмульсии, при контакте которых с меченым объектом на них остаются следы электронов. Так изотоп подает сигнал о своем местонахождении, и это позволяет проследить движение, перераспределение и превращения определенных веществ клетки. Разработаны способы количественного анализа радиоавтографов, что расширяет возможности метода.
Метод культуры клеток и тканей используют при подготовке к исследованию живых клеток в условиях, благоприятных для их жизнедеятельности и размножения. Небольшие кусочки тканей, органы или отдельные клетки можно культивировать в стерильных условиях на питательной среде m vitro при оптимальной для них температуре. Культуру периодически переносят в свежую питательную среду для длительного сохранения жизнеспособности. Однослойные культуры клеток удобны для прижизненных наблюдений методом фазового контраста и киносъемки. Так можно проследить весь жизненный цикл клеток. Из отдельных клеток можно вырастить целые растения. В последние годы интерес к этому методу возрос в связи с возможностью использовать его при изучении генетики соматических клеток: в биотехнологии — для выращивания зародышей на искусственной питательной среде, при клеточной инженерии, позволяющей получать парасексуальиые гибриды путем слияния изолированных протопластов разных видов растений и гаплоидов из клеток пыльников.
Нередко возникает необходимость вмешаться во внутренние процессы, протекающие в клетке. Это достигается при помощи тонкого метода исследования — микрургии. Она позволяет проводить трансплантацию ядер из клетки в клетку, определять
прижизненную кислотность отдельных структур, измерять биотоки, температуру и т. д. Для выполнения подобных операций необходимы прибор микроманипулятор ММ-1 с микроскопом и набор стеклянных игл, пипеток, петель, электродов и т. д.
В цитологии микрургические операции проводят обычно на клеточном уровне, в эмбриологии — на зародышах или их органах. Для микрургии объект заключают в стеклянную камеру, заполненную определенной средой, и все операции выполняют под микроскопом.
В зависимости от цели и объекта исследования можно использовать один или несколько указанных выше методов. Так, в кариологии чаще работают методом фиксации с последующим окрашиванием тканей и клеток. Цитофизиологи предпочитают прижизненные наблюдения, а в цитохимии сочетают фиксацию, лиофилизацию, авторадиографию, прижизненные наблюдения, окрашивание и др.
Совокупность приемов, направленных на выявление локализации определенных веществ в тканях и клетках, получила название микроскопической гистохимии. В последние годы для изучения химии клеточных структур все чаще используют абсорбционные оптические методы, которые^в совокупности называют цитофотометрией. Она делится на ультрафиолетовую и видимую. Последняя базируется на применении специфичных красителей.
Для фотометрирования используют микрофотометрические насадки (ФМЭЛ-1, ФМЭП-1), цитофотометры (МЦФВ-1, МЦФУ-1), универсальные микроскопы-фотометры, микросиек-трофотометры. Цитофотометр состоит из микроскопа и микропроектора. Анализ препарата ведут в монохроматическом свете с длиной волны, лежащей в пределах поглощения исследуемого вещества. Методы цитофотометрии позволяют измерить содержание поглощающих веществ в клетке и ее структурах.
