Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Первый отечественный электронный микроскоп был построен в 1940 г. в лаборатории А. А. Лебедева Государственного оптического института. За небольшой отрезок времени при помощи электронного микроскопа ученые получили новые данные о тончайшей структуре и форме уже известных оргаиелл, открыли новые структуры в клетке, проникли в мир вирусов и молекул органических веществ.
Метод электронной микроскопии не позволяет вести наблюдения за живыми объектами.
В последние годы в практике исследований поверхностных структур клеток и тканей стали применять сканирующие электронные микроскопы. Принцип устройства такого микроскопа был предложен еще в 1935 г. Кнолем. Однако промышленные модели появились лишь во второй половине 60-х годов текущего столетия.
В последнее время созданы зарубежные и отечественные модели сканирующего (СЭМ), или растрового, электронного микроскопа (РЭМ).
Микроскопы этого типа дают возможность изучать сравнительно крупные объекты: до 12 мм в диаметре и 3 мм толщиной. Полезное увеличение имеет широкий интервал: от 20 до 40 ООО, Глубина резкости изображения в 300—500 раз выше, чем у светового микроскопа. Разрешающая способность 2000—2500 нм, есть модели и с еще более высоким разрешением — порядка 500—1000 нн,. Стереоскопический эффект изображения позволяет получить дополнительную информацию. Фотографирование объекта осуществляется с экрана кинескопа.
Особенно привлекает исследователей в этом типе электронного микроскопа то, что нет необходимости подвергать объекты для исследования сложной обработке; не требуются окрашивание, проводка через серию жидкостей, изготовление ультратон-них срезов, которые необходимы для электронного микроскопа просвечивающего типа. Объект обычно приклеивают к объекто-держателю так, чтобы его толщина была меньше рабочего расстояния (между линзой и объектом), равного 5 мм. Сканирующий электронный микроскоп расширяет возможности изучения непрозрачных объектов, давая интересную информацию о поверхностных структурах. Так, его можно применять для исследования пыльцы, спор грибов, одноклеточных организмов, мик-ро- и мегаспор, волосков, устьиц, желёз и т. д.
Наша промышленность выпускает растровые электронные микроскопы модели РЭМ-200.
СПОСОБЫ ПОДГОТОВКИ К ИССЛЕДОВАНИЮ
И МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕШИ
Ознакомившись с микроскопом и методами наблюдения, кратко остановимся на методах исследования, при помощи которых накапливают данные о строении, функции, химическом составе клетки и ее структурных компонентов. К ним относятся: прижизненные наблюдения, изучение фиксированных и окрашенных клеток и тканей, высушенных замороженных, или лиофилизиро-ванных, объектов, цитохимия, дифференциальное центрифугирование, авторадиография, культура клеток и тканей, микрургия и др.
Почти каждый из перечисленных методов исследования непременно сопряжен с одним или несколькими методами наблюдения. Исследователь для получения информации о протекающих процессах на уровне клетки должен быть хорошо знаком с разными способами исследования клетки, которые неравноценны между собой, и каждый имеет свои достоинства и недостатки.
Прижизненные наблюдения объектов очень распространены в цитофизиологии. Пыльцевые зерна, пыльцевые трубки, рыльца, столбики, волоски тычиночных нитей нередко для изучения морфологии клетки, прижизненной кислотности, окислительно-восстановительного потенциала, степени дисперсности коллоидов протопласта, жизнеспособности, проницаемости и т. д. приходится смотреть под микроскопом в капле жидкости. Метод используют при просмотре искусственных культур клеток растений, грибов, бактерий. Вследствие низких показателей преломления содержимого живой клетки прижизненные наблюдения часто проводят на темном поле, в фазовом контрасте, поляризованном свете, флуоресцентным методом.
Препараты с живыми объектами недолговечны, а использование при работе с ними красителей ограничено вследствие их токсичности. Такие красители, как янус зеленый, нейтральный красный, метиленовый синий и другие, применяют для окрашивания живых объектов в слабой концентрации (от 10~4 до 10~5) и обрабатывают ими ткани всего несколько минут. Специальные красители — флуорохромы — применяют для изучения живых объектов в люминесцентном микроскопе. Для прижизненных наблюдений используют следующие среды: воду, раствор сахарозы, вазелиновое, парафиновое, силиконовые (ВИЖ-94а, полиси-лаксан) масла и др.
В 1970 г. И. Д. Романов наблюдал движение цитоплазмы, сочетая прижизненные наблюдения с методом фазового контраста. Таким образом он исследовал пыльцевые зерна пшеницы, ржи, овса от момента обособления пыльцевых зерен до образования крахмала, что совпадает с периодом спермиогеиеза, используя в качестве среды 5%-ный раствор сахарозы.
Фиксация с последующим окрашиванием клеток и тканей— один из наиболее распространенных способов Подготовки объектов к исследованию в цитологии и эмбриологии. Под действием химических фиксаторов (этиловый спирт, формалин, уксусная кислота и др.) в клетке прекращаются жизненные процессы, а ее химические компоненты осаждаются. После фиксации объект промывают. Дальнейшая обработка зависит от типа приготовления препарата. Можно окрасить материал сразу для изготовления временного препарата. Для получения тонких срезов толщиной в несколько микрометров объект обезвоживают, заключают в парафин и режут на микротоме. Срезы наклеивают на предметные стекла, освобождают от парафина и окрашивают. Красители подбирают так, чтобы повысить контрастность изображения отдельных структур, а в ряде случаев и выявить их химический состав, например ДНК, РНК, белки и др. Точное содержание химических веществ определяют на приборе — цитофотометре.
