Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Нефлуоресцирующие вещества можно обработать специальными флуорохромами и также наблюдать флуоресценцию, которая чаще используется в микроскопии, особенно в работе с живыми объектами для выявления локализации различных веществ.
К флуорохромам относятся: акридин желтый, акридин оранжевый, аурамин 00, конго красный, корифосфин, нейтральный красный, пироиин «Ж», примулин, родамин «С», родамин «6Ж», тиазиновый красный, титановый желтый, трипафлавин, флуорес-цеии, флуоресцеин-натрий (уранин), фуксин кислый (рубин «С»), хризоидин, эозин-натрий,- пирозолоновый желтый (тартразин), эритрозин. Эти вещества применяют в очень сильных разведениях (до 10~4) и хранят в посуде из темного стекла. Чаще всего используют акридиновые красители и анилиновый синий. Первые для выявления нуклеиновых кислот, второй — пыльцевых трубок.
Препараты, окрашенные флуорохромами, изучают в среде, которая не флуоресцирует под давлением коротковолновых лучей,— в воде, глицерине, вазелиновом масле или физиологическом растворе.
Для наблюдения объектов этим методом необходимо иметь: биологический микроскоп; источник возбуждения флуоресцентного света; светофильтры двух типов: выделяющие из источника света коротковолновые лучи (устанавливают после источника света, т. е. до объекта);
задерживающие возбуждающее излучение и обеспечивающие видимость объекта (ставят после объекта); флуорохромы.
Наблюдать флуоресценцию можно при помощи устройства ОИ-17, которое используют с биологическими микроскопами* источником света служит ртутная лампа. Кроме этого, ранее выпускались микроскопы: МЛ-2 — для отраженного и проходящего света, МЛ-3 — для отраженного света. Современная промышленность изготавливает для работы флуоресцентным методом микроскопы «Люмам Р» (рис. 22) и «Люмам И». Принцип действия флуоресцентного микроскопа не отличается от обычного, но осветительная и наблюдательная системы снабжены специальными светофильтрами. Объективы имеют на корпусе букву «Л».
Источником света служат лампы ртутно-кварцевые СВД-120А (сверхвысокого давления) и ДРШ-250 (дуговая, ртутная, шаровая). Более яркой является лампа ДРШ-250, которая включается через пульт, Есть лампы типа КИМ. В качестве осветителей используют ОИ-17, ОИ-18, ОСЛ-1 в виде приставок к микроскопу.
Для выделения коротких лучей служат светофильтры ФСЗ (фиолетовое стекло), СС14 (синее стекло), СС15, «запирающие» светофильтры ЖСЗ, ЖС18, Т1Н, Т2Н. Те и другие используют в определенных сочетаниях.
Флуоресцентный метод широко применяют в цитофизиологии. Он позволяет изучать живые объекты, устанавливать локализацию различных веществ и патологические изменения в тка-
нях, диагностировать заболевания в фитопатологии, выявлять пыльцевые трубки в эмбриологии и т. д.
Повышенный интерес исследователей к изучению строения и химическому составу различных структур клетки на неокрашенных препаратах, потребность количественного изучения нуклеиновых кислот и других соединений привели к использованию в микроскопии метода наблюдения в ультрафиолетовых лучах. В ультрафиолетовой части спектра находятся спектры поглощения многих веществ. Метод позволяет значительно увеличить разрешающую способность микроскопа, поскольку здесь работают лучи с короткой длиной волны. Кроме того, он дает возможность повысить контрастность неокрашенных препаратов, так как отдельные вещества препарата по.-разному поглощают коротковолновые лучи, т. е. имеют свой спектр поглощения. Это позволяет судить о его химическом составе. Так, нуклеиновые кислоты не поглощают видимый свет, но способны поглощать ультрафиолетовые лучи определенной длины волны. Шведский ученый Касперсон разработал методику анализа клеточных структур с учетом этого явления.
Для наблюдения объектов в лучах с короткой длиной волны советский ученый Е. М. Брумберг сконструировал ультрафиолетовый микроскоп МУФ-1 и предложил метод цветовой трансформации. Один из вариантов этого метода — фотографический— заключается в получении с бесцветных препаратов цветных микрофотографий, окраска которых определяется спектрами поглощения определенных веществ препарата в ультрафиолетовых лучах. Для этого можно воспользоваться биологическим микроскопом, имеющим оптику, прозрачную для ультрафиолетовых лучей (зеркально-линзовые объективы, кварцевый коллектор, кварцевые предметные и покровные стекла). Осветителем служит кварцевая ртутная лампа.
При помощи светофильтров выделяются лучи различной длины волны в невидимой ультрафиолетовой области спектра. Фотоснимки препаратов делают в лучах трех различных длин воли.
Цветные изображения получаются при помощи специального прибора — хромоскопа, проектирующего одновременно три микрофотографии на один экран. При этом каждый снимок освещается определенными видимыми лучами (синими, зелеными или красными). Путем цветовой трансформации удается выделить различные вещества клетки.
Прямые визуальные наблюдения в ультрафиолетовых лучах возможны с применением флуоресцирующего экрана, который помещается в окуляре микроскопа в плоскости действительного изображения препарата, даваемого объективом.
