Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Для работы методом фазового контраста при изучении неокрашенных препаратов используют зеленые светофильтры, окрашенных объектов — светофильтр того же цвета, что и объект.
Для исследования тонких неконтрастных препаратов, кроме метода фазового контраста, применяют фазово-темнопольный метод, позволяющий различить меньшие разности оптических плотностей. Фазово-темнопольные объективы имеют более высокую разрешающую способность, чем фазовые. Для работы необходимо специальное устройство МФА-2, которое используется с биологическими микроскопами.
Почти не отличается от фазово-контрастного устройства аноптральный микроскоп, © котором нет фазовой пластинки, но вблизи выходного зрачка объектива наносится поглощающая кольцевая пленка из копоти.
К методу фазового контраста близок принцип действия интерференционного микроскопа, схему которого для прозрачных объектов составил в 1932 г. А. А. Лебедев. В этом микроскопе свет сначала делится на два пучка, а затем они воссоединяются. Каждый пучок света после разделения имеет свой путь. Один из них проходит через объект, а другой — мимо него. Луч, проходя через объект, испытывает фазовый сдвиг, который можно измерить. Так как величина фазового сдвига связана с плотностью структуры, то таким образом можно определить содержание сухого вещества в клеточных структурах.
Для определения используют формулу
100а ’
где Р — масса, г; г — величина фазового сдвига, см; s — площадь объекта, см2; а —- константа (для белков а=0,0018).
В отличие от фазового контраста в интерференционном микроскопе живая клетка может иметь вид окрашенного препарата вследствие того, что на вторичное изображение объекта накладывается дополнительная световая волна, от взаимодействия с которой получается контрастное'или цветное изображение.
Метод наблюдения в поляризованном свете
Для изучения объектов, обладающих двойным лучепреломлением (крахмальные зерна, растительные волокна, кристаллы и др.), используют метод наблюдения в поляризованном свете. В цитологии этот метод применяют для изучения структуры митотического веретена, фибриллярных белков, крахмала и т. д.
Поляризованный свет отличается от обычного следующим свойством. Обычный свет распространяется в виде поперечных волн в различных направлениях. Если добиться колебания волн в одном направлении, то свет будет поляризованным.
Для наблюдений в поляризованном свете при помощи обычного микроскопа необходим поляризатор, помещаемый под конденсор микроскопа, и анализатор, который должен находиться над объективом. Для установки анализатора тубус снимают, кладут на объектив анализатор и устанавливают тубус. Менять объективы при наблюдении нельзя, чтобы не повредить анализатор.
При поляризации интенсивность света значительно уменьшается. От поляризатора свет идет к анизотропному объекту, оптические свойства которого неодинаковы в различных направлениях. Такой объект в отличие от аморфных и изотропных объектов способен влиять иа поляризованный свет.
Падая на объект, пучок света разделяется на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Один из них подчиняется обычному закону преломления (обычный луч), другой проходит через объект с иной скоростью (необычный луч). Поэтому выходить из объекта они будут неодновременно. Разность хода лучей можно измерить.
Для исследования изменения поляризованного света, прошедшего через объект, применяют анализатор, который помещают над объективом. Можно использовать красители: метиленовый синий, акридиновый оранжевый, риванол и др.
Во время наблюдений поляризатор и анализатор устанавливают строго параллельно. Плоскость поляризации вращается так, чтобы на темном поле анизотропные объекты ярко светились. Предметные столики специальных поляризационных микроскопов круглые, вращаемые, с лимбом для измерения углов поворота. Объективы — ахроматы. Поляризационная оптика входит в комплект микроскопов МБР-3, МББ-1, МБИ-15, кроме того, существует несколько моделей «Полам».
Метод флуоресцентной и ультрафиолетовой микроскопии
В последние годы при изучении биологических препаратов все чаще стали использовать метод флуоресцентной мик-
р о с к о п и и, при котором препарат рассматривают в свете, излучаемом самим препаратом.
Метод основан на том, что ряд соединений в клетке (хлорофилл, хинин, берберин) при освещении коротковолновыми лучами (фиолетовыми, ультрафиолетовыми и др.) способен светиться под микроскопом желто-зелеиым или оранжевым светом на темном фоне. Это так называемая собственная флуоресценция. Происходит она потому, что молекулы объекта после поглощения света сначала переходят в возбужденное состояние, а затем возвращаются в нормальное. Последний процесс сопровождается испусканием света, который теперь имеет не короткую, а гораздо большую длину волны, характерную для желто-зеленого или оранжевого света. Процесс испускания света называют люминесценцией. Если свечение прекращается сразу с прекращением возбуждения, то это явление называют флуоресценцией в отличие от фосфоресценции, т. е. длительного свечения после прекращения возбуждения.
