Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
5. После фокусировки микроскопа в поле зрения должно появиться кольцо с темным пятном в центре. Темное пятно исчезает при подъеме конденсора. Неправильная форма светлого пятна указывает иа то, что капля иммерсионной жидкости мала. Центрировочными винтами конденсора смещают светлое пятно в центр и приступают к наблюдению.
6. При работе с иммерсионными объективами внутрь их вкладывают специальную диафрагму для понижения апертуры до 0,85.
При использовании центральной диафрагмы ее помещают под столик' микроскопа на откидное кольцо конденсора, диафрагму которого оставляют открытой. На верхнюю линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды.
Метод фазового контраста и интерференционная микроскопия
Почти все живые клетки прозрачны для видимого света, т. е. световые волны, проходя через клетку, почти не теряют своей интенсивности, хотя фаза их изменяется. Человеческий глаз, фотопластинка и фотоэлемент не способны улавливать фазовые изменения, но зато реагируют на изменение интенсивности света, т. е. его амплитуды. Этого можно добиться окрашиванием объекта, но для живых клеток такой прием нежелателен,
В ранних исследованиях прозрачные объекты изучали или путем частичного закрытия ирисовой диафрагмы конденсора, что сопровождается потерей разрешающей силы, или путем
Рис. 20. Клетки верхнего эпидермиса лука:
.4 — фазово-контрастное изображение живых клеток, Б — те же клетки в светлом поле микроскопа. По В. Г. Конареву.
косого освещения. Голландский физик Цернике указал на возможность использования метода фазового контраста для наблюдения прозрачных объектов. Применяя этот метод, можно увидеть в живых клетках процесс митоза, хромосомы, митохондрии, мелкие включения, изучать действие на них физических и химических агентов и фиксаторов.
Метод основан на выявлении сдвигов фазы световых колебаний. Сдвиг фазы происходит вследствие неодинаковой скорости распространения света в средах различной плотности. Так как фазовые изменения не улавливаются глазом, то их преобразуют-в амплитудные, фазового контраста имеют фазовую
пластинку в виде кольца, которая получается в результате распыления специального вещества, образующего слой толщиной в несколько десятых долей микрометра. Апертурная диафрагма на конденсоре также кольцевая и имеет такие размеры, что ее изображение, передаваемое через конденсор и объектив, полностью укладывается на фазовое кольцо объектива.
Фазовое кольцо выполняет две функции: поглощает часть прошедшего света и сдвигает фазу невозмущенных лучей на п/2. Если свет задерживается по фазе, то объект выглядит светлее фона. Это так называемый негативный фазовый контраст.
При позитивном фазовом контрасте происходит опережение по фазе.
Указанный метод не изменяет разрешающей способности микроскопа, но чувствительность его возрастает, а слабые включения прозрачных объектов, невидимые в светлом поле, дают контрастную интерференцию с фоном и становятся видимыми.
Объективы для
Рис. 21. Фазово-контрастиое устройство КФ-4:
I — конденсор; 2 — револьвер; 3 — цент-рировочные винты; 4 --- вспомогательный микроскоп; 5 — совмещение фазового кольца объектива с кольцевой диафрагмой конденсора во время центрировки; слева — правильное, справа — неправильное.
Хороший объект для наблюдения митоза в прижизненном состоянии методом фазового контраста — волоски тычиночных нитей из молодых бутонов традесканции. Эпидермис луковиц репчатого лука можно использовать для наблюдения митохондрий (рис. 20). Растительные клетки, содержащие много зерен хлорофилла и других пигментов, дают неудовлетворительные изображения в фазовом контрасте.
Для проведения исследований необходимо к биологическому микроскопу иметь фазово-контрастное устройство КФ-4, состоящее из фазового конденсора с револьвером, вспомогательного микроскопа (рис. 21), специальных объективов, иа оправе которых имеется буква Ф. Выпускается также модель КФ-5.
Эффект фазового контраста наблюдается в том случае, если удается совместить фазовое кольцо объектива с кольцевой диафрагмой конденсора. Порядок работы при установке фазово-контрастного устройства следующий.
1. Заменяют в микроскопе обычный конденсор и объектив иа фазовые. При этом фазовый конденсор устанавливают для нормального освещения по методу светлого поля (на 0).
2. Устанавливают свет по Келеру и фокусируют тубус на препарат. Диафрагму конденсора оставляют полностью открытой.
3. Вынимают окуляр, вставляют в тубус вспомогательный микроскоп и фокусируют его резко иа изображение темного кольца в выходном зрачке объектива, не трогая рукояток грубой и тонкой подач микроскопа.
4. Устанавливают диск револьвера на цифру, соответствующую увеличению объектива, например на 10 или 40.
5. Центрируют кольцевую диафрагму конденсора (светлое кольцо) с фазовым кольцом объектива (темное кольцо) цент-рировочными винтами револьвера (см. рис. 21,5). Оба кольца должны совместиться.
6. Вынимают вспомогательный микроскоп и на его место в тубус вставляют окуляр.
