Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
При микроскопировании объекты исследования подразделяют на: прозрачные и непрозрачные, амплитудные и фазовые, изотропные и анизотропные (см. ниже). Для разных объектов, обладающих неодинаковой способностью рассеивать свет, применяют свои характерные методы наблюдения. При оценке любого метода обычно учитывают два критерия: во-первых,
какие вопросы можно’ решить при помощи данного метода, во-вторых, его доступность.
Метод светлого поля
Метод светлого поля в проходящем свете — один из наиболее распространенных и доступных для наблюдения. При прямом освещении им пользуются для изучения прозрачных объектов, у которых различные участки неодинаково поглощают свет, что и служит основой для создания изображения. К прозрачным объектам относятся срезы и отдельные клетки растений, которые монтируют на предметных стеклах и накрывают покровными.
В цитологии, эмбриологии, анатомии и цитохимии методом светлого поля в проходящем свете широко пользуются для изучения окрашенных препаратов.
Для изучения непрозрачных биологических объектов (например, мелких плодов) можно применить метод светлого поля в отраженном свете, при котором освещение идет сверху через объектив, служащий одновременно и конденсором.
Метод косого освещения относят к методу светлого поля. Косое освещение достигается путем смещения апертурной диафрагмы в направлении, перпендикулярном к оптической оси. Эффект косого освещения можно наблюдать в микроскопах с использованием конденсора ОИ-14.
Метод темного поля
При наблюдении объектов методом темного поля невозмущеи-ные лучи осветителя не попадают в объектив и изображение создается только рассеянными лучами, идущими от объекта. В этом случае в объектив попадает свет, отраженный от объекта, и тогда можно увидеть на темном поле светящиеся ультра-микроскопические частицы, размер которых меньше предельной
разрешающей способности объектива. Однако точно измерить и определить форму частиц трудно. Этот метод был разработан австрийским ученым Р. Зигмонди.
Темнопольную микроскопию в проходящем свете используют для получения изображения прозрачных объектов, плохо видимых при наблюдении в светлом поле, например живых клеток. Вместо обычного здесь применяют темнопольный конденсор ОИ-13, освещающий объект сбоку. Прямые лучи в объектив не попадают, фон получается темным, а яркость объекта достигается за счет рассеяния света от отдельных его частиц.
Темное поле позволяет вести наблюдения за изменением степени дисперсности коллоидов .протопласта. Здесь легко установить явление коагуляции. Совершенно по-разному выглядят на темном поле погибающие и нормальные клетки. Протопласт погибающих клеток ярко светится, тогда как у нормальных он светится слабо, за исключением оболочки.
В темном поле можно увидеть мелкие органеллы, например митохондрии. В качестве объектов для наблюдения в темном поле можно использовать эпидермис луковиц лука, корневые волоски пшеницы, водоросль спирогиру и др. Метод позволяет увидеть бактерии, поэтому его применяют в микробиологии. При темнопольной микроскопии необходимо соблюдать ряд правил:
иммерсионная жидкость и препарат не должны содержать пузырьков воздуха. Во время работы препарат касается иммерсионной жидкости, которую наносят на верхнюю линзу конденсора;
берут предметные стекла толщиной 0,8—1,2мм, покровные —
0,17 мм. Стекла должны быть абсолютно чистыми, так как каждая пылинка рассеивает свет и создает нежелательное освещение темного поля;
объекты должны быть малой толщины (лучше, если клетки расположены в один слой). Толстые объекты непригодны. Средой для заключения объектов обычно служит вода;
необходимы темнопольный конденсор ОИ-13 (см. рис. 2,Б) или центральная диафрагма (рис. 19), которую можно изготовить из черной плотной бумаги. Внутренний диаметр такой диафрагмы (в мм) зависит от апертуры объектива (Д=20А), а наружный равен диаметру откидного кольца конденсора. Центральную диафрагму удобно приклеить на матовое стекло;
Рис. 19. Центральная диафрагма для темного поля. По Г. Аппельту.
,необходима тщательная центрировка света с соблюдением принципа Келера;
наиболее контрастные изображения получают при малых увеличениях объектива с открытой диафрагмой конденсора.
Проводить наблюдения методом темного поля можно при помощи микроскопов «Биолам Р», МБР-3, МБИ-3, а также микроскопов МББ-1, МБИ-11 и МБИ-15, в комплекты к которым входят темнопольные конденсоры.
Порядок работы с использованием конденсора ОИ-13 следующий.
1. Устанавливают осветитель перед микроскопом, включают его и направляют пучок света на зеркало.
2. Удаляют конденсор ОИ-14, объектив и окуляр, а затем прикрывают диафрагму осветителя.
3. На тубус помещают,матовое стекло и зеркалом центрируют пучок света.
4. Ставят конденсор ОИ-13 и на его верхнюю линзу наносят каплю иммерсионной жидкости. Помещают препарат иа столик и .подъемом конденсора добиваются соприкосновения жидкости с предметным стеклом. Затем ввинчивают слабый объектив.
