Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Системы рестрикции-модификации типа II устроены наиболее просто [74, 75]. В таких системах модифицирующая ДНК-ме-тилтрансфераза функционирует в виде свободного мономера, а эндонуклеаза рестрикции - в виде димера, причем эти два фермента не зависят друг от друга. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, они активны в присутствии ионов Mg2+ без каких-либо дополнительных кофакторов и чаще всего используются при молекулярном клонировании, а также в ДНК-диагностике.
В системах рестрикции-модификации типа III субъединица ДНК-метилтрансферазы (Mod) распознает асимметричный сайт рестрикции (рис. 2) [76]. Эндонуклеаза (Res) может выполнять свои функции только в комплексе с Mod-субъединицей, причем
рестрикция стимулируется S-аденозилметионином. Res-субъеди-ница обладает активностью ATP-зависимой ДНК-хеликазы, необходимой для транслокации комплекса вдоль ДНК, которая прекращается после встречи комплекса с препятствием. Однако, в отличие от рестриктаз типа I, связавшийся с ДНК репрессор может блокировать транслокацию, но разрыв происходит не в месте остановки комплекса. Для эффективного расщепления ДНК требуется наличие двух расположенных по соседству комплексов, взаимодействующих с неметилированными сайтами узнавания, которые расположены в обратной ориентации по отношению друг к другу. Например, хромосома фага Т7 содержит 36 сайтов узнавания рестриктазой ЕсоР\51, но в одной ориентации, и эта ДНК полностью устойчива к действию данной эндонуклеазы. Ясно, что такая ориентация сайтов не могла возникнуть случайно (вероятность 1/236 или 1/7 х 1010) и является результатом естественного отбора. Механизм запуска расщепления ДНК в этой системе пока неизвестен.
Системы рестрикции-модификации типа IV распознают асимметричные последовательности, отступя от которых на определенные расстояния, делают разрезы ДНК, что сближает их с системой IIS (см. ниже и рис. 2) [77]. Однако, в отличие от IIS, в системе типа IV эндонуклеазная и ДНК-метилтрансферазная активности находятся в составе одной полипептидной цепи, а эндонуклеазная активность стимулируется S-аденозилметионином. Эта метилтрансфераза метилирует лишь одну цепь ДНК, чего недостаточно для подавления рестрикции в данном сайте. В системе типа IV обнаружена вторая метилтрансфераза, которая метилирует обе цепи ДНК, что делает сайт устойчивым к соответствующей эндонуклеазе.
lteg-подобная система рестрикции-модификации названа так по своему ферменту-прототипу Bcgl, выделенному из Bacillus coagulans [78]. Так же, как и в предыдущем случае, в этой системе эндонуклеазная и ДНК-метилтрансферазная активности объединены в одной полипептидной цепи субъединицы А или ос, с ними не ассоциирована ДНК-хеликазная активность, действие эндонуклеазы стимулируется S-аденозилметионином (который также является донором метальных групп для метилтрансфера-зы) и не требует АТР. В отличие от системы IV, ?с#-подобная система обладает второй субъединицей В (или Р), которая обеспечивает специфичность действия ферментов. Аналогично системе I, эта система распознает двойной сайт, разделенный случайной последовательностью, однако вносит два двухцепочечных разрыва по обе стороны от сайта (см. рис. 2).
2.2.2. Рестриктазы типа II -
основной инструмент генной инженерии
Большинство рестриктаз типа II специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, и, по крайней мере, три из них - октануклеотиды. При этом некоторые ферменты узнают частично вырожденные последовательности (например, Hincll - GTYRAC, где Y и R, соответственно, пиримидин и пурин), другие - симметричные последовательности, разделенные случайной последовательностью нуклеотидов (Bgll - GCCN5GGC), сайты рестрикции третьих -квазисимметрич-ны (Btrl - САС A GTC, где А обозначает точку расщепления), из-за чего их иногда называют ферментами muna IIQ. Ферменты типа 115 (от англ. shift) вносят разрывы в ДНК, которые смещены на несколько нуклеотидов относительно сайта рестрикции (см. рис. 2).
Чем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов, в которой каждый из четырех нуклеотидов представлен с одинаковой частотой (50% А-Т-пар и 50% G-C-nap). Так, случайная тетрануклеотид-ная последовательность встречается в среднем через каждые 256 п.о. (44), а гексануклеотидная - через каждые 4096 п.о. (46). Однако, в природных ДНК распределение нуклеотидов может заметно отличаться от случайного. Например, для эукариотических ДНК характерна низкая частота встречаемости динуклеотида CpG и, соответственно, сайтов рестрикции, содержащих эти динуклеотиды (рестриктазы Hhal, Hpall, Taql, Thai, Aval, НаеII, Hindll, Sail, Smal, Xhol, Xmal). Существенное отклонение частоты встречаемости сайтов рестрикции от ожидаемого при случайном их распределении вдоль ДНК имеет место и в хромосомах термофильных бактерий, которым, напротив, свойственно (хотя и не во всех случаях) обогащение по G-C-парам. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами типа И, характерно наличие в них симметрии второго порядка, т.е. узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например, у рестриктазы ?coRI - 5'-GAATTC-3'. Это означает, что нуклеотиды, расположенные в каждой из цепей на равном расстоянии от оси симметрии, комплементарны друг другу. Если точки расщепления противоположных цепей ДНК смещены друг относительно друга в сайте рестрикции, то образующиеся в результате рестрикции концы ДНК содержат выступающие одноцепочечные участки. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и
