Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Повышение в 3 • 105 раз термостабильности эстеразы Bacillus stearothermophilus после иммобилизации по аминогруппам на глиоксил-агарозе [339]
Девятикратное повышение времени полужизни ацилазы пенициллина G при 55 °С без уменьшения значений Vmax [340]
Проведение химических модификаций и введение поперечных сшивок в кристаллический полусинтетический селеносубтилизин сопровождались появлением пероксидазной активности, десятикратным увеличением стабильности фермента без потери энантиоселективности [341]
Создание липидной оболочки вокруг маннозидазы, глюкозидазы и глюкоза-минидазы делает поверхность ферментов гидрофобной и в семь раз повышает их способность к трансгликозилированию в среде изопропилового эфира [163]
По сравнению с исходным ферментом активность модифицированной ката-лазы в трихлороэтилене возрастает в 200 раз, а в водных растворах - в 15 раз [154]
50-кратное повышение n-нитробензилэстеразной активности субтилизина в 30% диметилформамиде [343]
рода результаты привели к необходимости пересмотра широко распространенного мнения, согласно которому активность и стабильность ферментов связаны друг с другом реципрокными отношениями благодаря глобальной конформационной гибкости полипептидных цепей, задействованной в ферментативном катализе. Постепенно складывается впечатление, что процесс денатурации запускается общими инициаторами и/или механизмами, которые индуцируются высокой температурой, неоптимальными значениями pH, органическими растворителями или детергентами. Как следствие этих наблюдений появилась возможность путем улучшения термостабильности ферментов одновременно повышать их устойчивость и к другим вредным экстремальным условиям. Хотя среди современных методов стабилизации белков преобладают химические (иммобилизация и введение химических поперечных сшивок), разработка новых подходов, в которых используется экспрессия белков на поверхности клеток [338], многоточечное ковалентное сшивание белков с носителями [344], введение поперечных сшивок в кристаллические ферменты [341], а также рассмотренные выше методы направленной эволюции белков и, возможно, рационального дизайна будут превалировать в создании новых биокатализаторов для нужд промышленности будущего.
Конструирование ферментов методами белковой инженерии сопровождается постепенным освоением новых областей исследуемого пространства последовательностей и на этом пути продвижения в неведомое наблюдается значительный прогресс (рис. 59). Методы классического скрининга белков с новыми свойствами, основанные на последовательном переборе отдельных различающихся последовательностей, дают возможность исследовать лишь очень ограниченное количество не связанных друг с другом представителей из теоретически доступного пространства последовательностей в разных его областях. Картина изменяется лишь незначительно при анализе большого количества геномов разных видов в процессе метагеномного скрининга. Методы направленного и случайного мутагенеза позволяют незначительно отклониться от исходной последовательнбсти и исследовать пространство последовательностей в ее окрестностях. Случайное объединение доменов разных белков и, особенно, комбинаторная перетасовка нуклеотидных последовательностей разных геномов дают возможность обследовать брлее удаленные друг от друга области пространства последовательностей. Тем не менее, наши современные возможности пока не позволяют подойти к решению этой проблемы более широко, и в исследуемом
НИ""
: :
: :
: : :
: : I i :
ПШ i! Ш
N||
!! t! 111 iMii|S
i ;
i
11
i i ш
mi
III!
Классический скрининг с использованием микробиологических и энзимологических методов
i ; ; ! ! I i :::::::
i i
шшшмипимм i •: i i i !:• i :•••;!
t
i i i! i iIIflitl! I* T rill it Ц
пиши T
ШШШ1Ш1
i! ! ! j Ii ! i !!i i ! ! !
!N!!n!l!lU!i!: i!f|lf!!!iLiU*i!
Множественный (метагеномный) скрининг
Направленный или случайный мутагенез
Объединение белковых доменов
Случайное рекомбинирование фрагментов ДНК разных геномов
Рис. 59. Перемещение по пространству последовательностей белковых молекул с помощью разных методов, используемых в современной белковой инженерии
пространстве последовательностей еще долгое время будут оставаться обширные белые пятна.
Вне зависимости от того, какая из двух обсуждавшихся выше концепций дизайна биотехнологических процессов будет преобладать в будущем, одним из основных вопросов белкой инженерии, по-видимому, останется вопрос о пределе совершенства идеального биокатализатора. Прежде всего необходимо выяснить, какие факторы лимитируют функции известной белковой молекулы, а поняв это потребуется найти способы преодоления таких ограничений. Рациональный дизайн белков развивается медленно из-за сложности объекта исследований. Пока не удалось даже установить основные закономерности, определяющие термостабильность белковых молекул для того, чтобы сознательно изменять это свойство в нужном направлении. В то же время методы направленной эволюции белков в последнее время быстро распространяются и находят все большее применение, поскольку по своей сути не требуют от исследователя предварительных знаний о структурно-функциональных отношениях в эволюционирующих макромолекулах. Прогресс в понимании структурно-функциональных взаимосвязей в белковых молекулах определит популярность рационального дизайна белков. А поскольку открытия в науке предсказать невозможно, делать прогнозы о ближайшем будущем развитии таких мощных направлений молекулярной биологии и генетики как генная и белковая инженерия - дело неблагодарное.
