Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Узким местом, ограничивающим применение проточных цитометров для наработки метафазных хромосом в препаративном количестве, достаточном для их использования в молекулярно-генетических исследованиях, является скорость сортировки, а следовательно, и время, которое необходимо затратить для реализации соответствующих проектов. В табл. 2 приведены количества метафазных хромосом, которые требуются для проведения ряда генно-инженерных экспериментов. При использовании обычных сортировщиков, которые анализируют До 1000 частиц/сек, индивидуальные хромосомы человека можно накапливать лишь со скоростью ~40 хромосом/сек (1000/23). Ясно, что в этом случае 106 хромосом теоретически могут быть получены только за семь часов непрерывной работы прибора, а следовательно, для наработки 6,4 х 107 хромосом, требуемых
для получения одной клонотеки на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC), потребуется по крайней мере 21 день. Естественно, решение этой проблемы лежит на пути совершенствования техники сортировки. Высокоскоростные сортировщики позволяют получать в сутки до 1,5 х 107 индивидуальных хромосом человека. Еще большей производительности удается достигнуть с применением оптической сортировки хромосом. Этот подход позволяет нарабатывать в сутки до 7,5 х 107 отдельных хромосом человека.
Все упомянутые выше методы очистки нуклеиновых кислот при использовании в качестве исходного материала клетки бактерий, животных или растений дают в руки исследователей сложную смесь генов и некодирующих нуклеотидных последовательностей. Для выделения конкретных последовательностей нуклеотидов и работы с ними необходимо использовать многочисленные ферменты. Свойства некоторых ферментов, широко используемых в генной инженерии, кратко рассмотрены ниже.
2.2. Ферменты рестрикции и модификации нуклеиновых кислот
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции - рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бактерий, в которых они были обнаружены, например, Есо - Е. coli. В том случае, когда различные по специфичности действия рестриктазы присутствуют в клетках разных штаммов одного вида бактерий, в название рестриктазы вводят дополнительную букву, например, рестриктазы Hinc и Hind выделены из бактериальных клеток Haemophilus influenzae, штаммы end. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последовательность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бактерий одного вида, например, НаеI, НаеII и НаеIII - из Н. aegipticus.
2.2.1. Классификация систем рестрикции-модификации
По механизму действия и молекулярной структуре различают пять типов систем рестрикции-модификации и соответственно рестриктаз, но нет основания считать, что эта классификация
Тип Субъединичный
системы состав
Примеры Субстрат Метали-
(А= расщепление) рОВЭНИе
II
IIS
III
IV
TGANgTGCT ( N6mA) VDI8NVDOV
AACN6GTGC (N6mA) 1Ю9МЭУЭО
CGATNyGTTA
ODIV^NDWI
oo
Eco RI
Hhal
Pvull
GAAATTC
GCGAC
CAGACTG
( N6mA) (5mC) (N4mg)
ggatgn9a
ЭЭ1УЭ N13A GGTGAN8a
dda3in7a
gaagan8a
diidin7a
( N6mA) ( N6mA)
(N6mA) (5mc)
( N6mA)
(N4m?)
Eco?l AGACCN?A (N6m^)
Eco?\5 I CAGCAGN25a (N6mA) %LTI CAGAGN?A (N6mA)
EcoSll CTGAAGN16A (N6mA)
Gsu\ CTGGAGN16A (N6mA)
MmeI TCCRACN20a (N6mA)
/teg-подобная
Bcgl aN10CGAN6TGCN12a
Bpll aN8GAGN5CTCN13a
Bael A N10ACN4GTAYCN12 a
- Распознающий домен (НеГ) -ДНК -геликаза
- Модифицирующая метилаза - Эндонуклеаза рестрикции
Рис. 2. Типы бактериальных систем рестрикции-модификации [76]
Подчеркнуты нуклеотиды сайтов рестрикции, подвергающиеся метилированию гомологичными системами модификации по указанному положению
AQ
исчерпывает все классы природных ферментов (рис. 2). Рестриктазы типа I представляют собой сложные мультимерные комплексы, которые входят в состав системы рестрикции-модификации, построенной из пяти субъединиц, две из которых (HsdM -host specificity determinant) обладают ДНК-метилазной активностью, для двух других (HsdR) характерна эндонуклеазная и ДНК-хеликазная активности, и одна (HsdS) обеспечивает специфичность взаимодействия комплекса с ДНК [73]. Тримерный комплекс M2S метилирует ДНК, однако рестрикцию может осуществлять только гетеропентамер M2SR2. Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия АТР, S-адено-зилметионина и ионов Mg2+. Они распознают асимметричные, состоящие из двух частей последовательности нуклеотидов, и в том случае, если сайт неметилирован, прочно связываются с ним, что приводит к ATP-зависимой активации хеликазы. В результате комплекс начинает перемещаться вдоль ДНК, расплетая ее и оставляя по бокам обе цепи ДНК в виде петель. Расщепление ДНК происходит после остановки комплекса в том случае, если он встречает непреодолимое препятствие на своем пути, например в виде второго такого же комплекса или структуры Холидея, образовавшейся в ходе рекомбинации. Линейные молекулы ДНК, содержащие один сайт связывания, являются плохими субстратами для этих ферментов. В результате расщепление ДНК происходит за тысячи п.о. от сайта узнавания с образованием длинных 3'-выступающих одноцепочечных концов. С учётом гомологии аминокислотных последовательностей рестриктазы типа I подразделяют на четыре семейства (IA-ID). В силу всех вышеупомянутых особенностей эти интересные ферменты не находят широкого применения в генной инженерии.
