Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
3.6.3. Изменение стереоспецифичности
Стереоспецифический синтез хиральных химических соединений привлекает большое внимание исследователей, работающих в области фундаментальной химии и промышленного органического синтеза. Вспомним, что хиральностью называют свойство объектов, обладающих жесткой пространственной структурой (в том числе геометрического места точек или атомов молекулы), быть несовместимыми со своими зеркальными отображениями. По определению такие объекты не имеют элементов симметрии второго порядка. В химии каждого из пары хиральных соединений, являющихся несовместимым зеркальным отображением один другого, называют энантиомером. Проведение стереоспецифического синтеза в лаборатории или промышленных масштабах требует большого количества очищенных оптических изомеров соединений-предшественников и является весьма дорогостоящей процедурой. В этой связи не прекращается поиск эффективных энантиоселективных катализаторов, среди которых все большее внимание привлекают ферменты и каталитические антитела. Хотя в ряде случаев стереоспецифичность
ферментов оставляет желать лучшего, ее можно существенно улучшить с помощью направленного мутагенеза, изменяя последовательность аминокислотных остатков вблизи активного центра. Однако одно из радикальных решений проблемы улучшения энантиоселективности ферментов дает недавно примененный для этой цели подход, основанный на направленной эволюции белковых молекул [327].
Методы отбора энантиоселективных мутантных ферментов. Традиционные методы, основанные на анализе продуктов реакции методом ВЭЖХ, газовой хроматографии в хиральной фазе или капиллярного электрофореза, в силу своей трудоемкости и низкой производительности, не позволяют проводить крупномасштабный отбор мутантов из больших клонотек. С использованием этих методов удается проанализировать в день не более нескольких десятков образцов, тогда как потребности белковой инженерии в таком анализе на несколько порядков выше. Одним из наиболее перспективных современных методов, используемых для решения этой задачи является масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле (electrospray ionization mass spectrometry - ESI-MS) [328]. (R)- и (5)-энантиомеры обладают одинаковыми масс-спектрами, и их невозможно определить количественно без предварительного хроматографического разделения. Однако, если один из энантиомеров пометить тяжелым изотопом (дейтерием), смесь меченого и немеченого энантиомеров уже можно эффективно анализировать по масс-спектру и количественно определять избыток конкретного энантиомера (enantiomeric excess - ее) в смеси, а следовательно и фактор селективности фермента (Е) в отношении конкретных энантиомеров.
Два других подхода, активно используемых для количественного определения энантиомеров в смеси, включают капиллярный матричный электрофорез (capillary array electrophoresis -CAE) [318] и капиллярный электрофорез на микрочипах (capillary electrophoresis on microchips - CAE on chips) [313]. Оба метода кроме того применяются при секвенировании ДНК, анализе олигонуклеотидов и продуктов ПЦР и позволяют исследовать сотни тысяч образцов в день. В случае САЕ прибор для капиллярного электрофореза, оснащенный 96 капиллярами длиной в 50 см, позволяет одновременно анализировать соответствующее количество образцов из 96-луночных плашек.
С использованием недавно разработанного подхода, который был назван дерацемизацией, удается осуществлять биосинтез оптически чистых аминов [329]. В этом случае аминооксида-зе Aspergillus niger, которая исходно обладает способностью
Промышленное использование модифицированных ферментов для стереоспецифического синтеза химических соединений в Германии [330]
Процесс Субстрат Продукт Фермент Масштаб Фирма
производ
ства (т/год)
Разделение Рацемиче Энантио- Липаза 1000 BASF
ские спирты меры
спиртов
Разделение Рацемиче R- и S-ами- Липаза 100 BASF
ские амины ДЫ
Кинетическое Рацемиче L-амино- Амидаза 100 DSM
разделение ские амиды кислоты
аминокислот
Аминирова- Фумаровая L-acnapa- Аспартат- 100 DSM
ние кислота гиновая аммиак-
кислота лиаза
окислять бензиламин, с помощью направленной эволюции придали способность использовать в качестве субстрата стереоизомер (5)-а-метилбензиламин. Полученный таким образом мутантный фермент (Asn336Ser) оказался в 50 раз более активным в отношении (5)-а-метилбензиламина, чем исходный, и в семь раз превышал его энантиоселективность. Использование этого фермента в сочетании с восстанавливающим агентом позволило дерацемизировать рацемическую смесь а-метилбензиламина с выходом 73% (Я)-энантиомера и 93%-ным избытком энантио-мера (ее).
