Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
3.6.2. Рестриктазы
Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза EcoKV наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319].
Помимо чисто научного, у белковых инженеров имеется к ре-стриктазам и утилитарный интерес, как незаменимому инструменту молекулярной генетики. Действительно, если среди ферментов, узнающих четырех- и шестинуклеотидные сайты рестрикции, имеются представители, которые расщепляют все теоретически возможные палиндромные сайты такой длины, то круп-нощепящих рестриктаз, действующих на 8-звенные, а тем более 10-звенные сайты рестрикции, известно очень мало. Скорее всего, список природных крупнощепящих рестриктаз не будет сильно расширен, поскольку их присутствие в бактериальной клетке не дает ей больших селективных преимуществ. Действительно, из статистических соображений 8-звенная уникальная последовательность встречается в случайной последовательности нуклеотидов не чаще, чем через каждые ~66 ООО п.о., и система рестрикции-модификации, построенная с использованием таких ферментов не сможет эффективно защитить бактерию от вирусной инфекции. Тем не менее крупнощепящие рестриктазы остро вос-
требованы в современных исследованиях для получения и клонирования больших фрагментов ДНК. В этой связи предпринимаются попытки искусственного создания таких ферментов.
Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз EcoRl и EcoRY с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы.
Пока с помощью рационального редизайна удается изменить специфичность рестриктаз только в отношении их действия на модифицированные субстраты. С использованием такого подхода был получен мутант EcoRl, который с разной эффективностью расщеплял сайты рестрикции, содержащие в положении 4 остатки урацила или тимина (GAAUTC и GAATTC) [321]. Также были получены мутанты EcoRY, которые проявляли 220-кратное предпочтение в отношении сайта GATAUC перед сайтом GАТАТС [322]; другой мутант этого фермента предпочтительно (в ~103 раз более эффективно) расщеплял сайт, где одна из фосфатных групп была заменена метилфосфонатом (GATATgC) (подчеркнута), хотя фермент дикого типа действует на обе последовательности одинаково [323].
Полипептидная цепь рестриктаз класса II состоит из двух доменов - распознающего ДНК и каталитического. Исходя из этого, были получены химерные белки, содержащие домены разных ферментов (не обязательно рестриктаз), и исследована их специфичность. Наибольшей функциональностью обладал гибридный
белок, полученный из каталитического домена рестриктазы FokI, объединенного с ДНК-связывающим доменом, который состоит из трех “цинковых пальцев”, а также аналогичных доменов факторов транскрипции. Поскольку каждый из “цинковых пальцев” взаимодействует с тремя основаниями ДНК, то путем изменения их количества в гибридном белке, а также аминокислотных остатков, из которых они построены, удавалось менять специфичность действия такой химерной рестриктазы [324]. Объединение того же каталитического домена в одной полипептидной цепи с ДНК-распознающими доменами факторов транскрипции, относящихся к гомеодоменному типу, а также типу Gal4, также приводило к созданию активной эндонуклеазы конкретной специфичности [325, 326]. В этом случае эффективное расщепление двухцепочечной ДНК наблюдали только при наличии в полипептиде двух близко расположенных копий ДНК-связывающего домена, что соответствует механизму действия димерной рестриктазы Fokl. В отличие от нативной рестриктазы, которая разрезает ДНК, отступя 9 и 13 п.о. от сайта узнавания, т.е. создает одноцепочечные липкие концы длиной в 4 нт, гибридные рестриктазы создают липкие концы другой длины. Химерные рестриктазы потенциально могут использоваться для стимуляции гомологичной рекомбинации в клетках in vivo.
