Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
----> + Глицерин
Сдвиг pH => Изменение окраски jg
Источник углерода => Ускорение роста
03РО
но он
Изомераза
NHR
Лг-[(5-Фосфорибозил)формимино] -5-аминоимидазол-4-карбосиламидрибонуклеотид-изомераза, кодируемая геном hisA
НО О
Фосфорибозилантранилатизомераза, кодируемая геном trpF
R:
О
R:
<'
N
N
со2-
В этом случае с помощью рационального дизайна была модифицирована система основных петель в консервативном домене (а/р)8-цилиндра ((a/p)8-barrel) ИГФС и эта новая конструкция (про-ФРАИ) была применена в качестве исходной для осуществления ее направленной эволюции с использованием случайной рекомбинации мутантных генов и ступенчатого удлинения олигомеров. Отбор проводили по появлению у ауксотрофных клеток Е. coli с мутантным геном ФРАИ способности расти в отсутствие Тгр в питательной среде. Полученный мутантный фермент обладал 28% гомологии с ИГФС и 90% гомологии с ФРАИ и проявлял <4% исходной активности.
Среди достижений применения подходов второй группы к изменению субстратной специфичности ферментов можно отметить получение фукозидазы из р-галактозидазы Е. coli [312]. Используя случайный мутагенез и отбор среди 10 ООО колоний в каждом раунде селекции по способности гидролизовать хромогенный субстрат онитрофенилфукопиранозид, выделили мутанты р-галактозидазы, у которых в 1000 раз возросла специфичность (ккат/Км) по отношению к этому искусственному субстрату по сравнению с онитрофенилгалактопиранозидом и в 300 раз по отношению к соответствующим я-нитрофенольным производным. Попытки превратить р-галактозидазу в р-глюкозидазу не увенчались успехом. Зато в других опытах с помощью комбинаторного мутагенеза удалось изменить субстратную специфичность оксидазы галактозы таким образом, что она начала использовать глюкозу в качестве субстрата [313]. В этом случае насыщающему мутагенезу подвергли последовательности нуклеотидов гена, кодирующие аминокислотные остатки активного центра фермента Arg-330, Gln-406 и Тгр-290. Один из мутантных белков, полученный в результате введения трех точковых мутаций, которые сопровождались заменами Arg330Lys, Gln406Tyr и
Trp290Phe, эффективно окислял D-глюкозу, а также некоторые другие первичные спирты и один вторичный спирт.
С помощью случайного мутагенеза и отбора удалось изменить субстратную специфичность Р450-монооксигеназы В. mega-terium (Р450 ВЗ) таким образом, что образующиеся продукты под действием кислорода воздуха спонтанно превращались в индиго и индирубин, которые удавалось нарабатывать в миллиграммовых количествах [314]. Всего три замены аминокислотных остатков обеспечивали мутантному ферменту изменения его каталитических свойств.
К достижениям использования подходов третьей группы можно отнести возможность резкого (~20-кратного) усиления активности Р450-монооксигеназы P. putida (P450cam) в отношении гидроксилирования нафталина, хотя ее наиболее эффективным субстратом является камфора [315]. Данный эффект достигался небольшим числом замен аминокислотных остатков в исходном ферменте. Среди таких мутантов были обнаружены и ферменты с изменившейся региоспецифичностью гидроксилирования. С помощью направленной эволюции удается превращать липазу
S. aureus в фосфолипазу, что сопровождается ~ 17-кратным усилением исходной (очень низкой) фосфолипазной активности [316]. С помощью того же подхода были получены 70-кратное усиление активности альдолазы Е. coli по отношению к нефосфо-рилированному D-2-кето-З-дезоксиглюконату и ослабление -в отношении его фосфорилированного аналога, а также новая активность в отношении L-глицеральдегида [317]. Количество аналогичных примеров можно увеличить.
Подходы, основанные на химической белковой инженерии, также дают возможность оказывать весьма существенное влияние на субстратную специфичность ферментов. В результате реализации таких подходов удается сочетать высокую избирательность катализа, которую обеспечивает полипептидная цепь, с каталитической универсальностью синтетических активных центров. Эффективность применения данной группы методов иллюстрируют результаты, полученные с классическим объектом белковой инженерии - сериновой протеиназой субтилизином [318]. Фермент был закристаллизован и непосредственно в кристаллическом состоянии стабилизирован поперечными сшивками с помощью глутарового альдегида. В таком состоянии субтилизин оказался нерастворимым в воде и органических растворителях, и демонстрировал очень высокий уровень стабильности. Далее остаток Ser-221, находящийся в активном центре субтилизина, был превращен химическими методами в производное селеноцистеи-
на. В результате протеолитический фермент приобрел новую активность пероксидазы и избирательно катализировал восстановление гидроперекисей. Более того, поскольку полу синтетическая пероксидаза и исходный протеолитический фермент обладали идентичными сайтами связывания субстрата, а субстратная специфичность субтилизина хорошо изучена, избирательность селе-носубтилизина в отношении субстратов оказалась предсказуемой. Это позволило осуществлять рациональный подбор субстратов для исследования новой пероксидазной активности полу-синтетического фермента.
