Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 181

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 175 176 177 178 179 180 < 181 > 182 183 184 185 186 187 .. 221 >> Следующая

Правильность такого рода соображений, а может быть просто их сильное влияние на психологию исследователей, которые отказываются подниматься на теоретически недостижимые вершины, подтверждается результатами, полученными в этой области. Все результаты по взаимопревращению или созданию новых ферментов условно разделяют на три группы [309]. К первой группе относят изменения ферментов, приводящие к тому, что они начинают метаболизировать субстраты, использованию которых природным аналогом мешают стерические препятствия на пути нового субстрата к активному центру, нетипичные взаимодействия электронов и т.д. Во вторую группу попадают результаты, в которых измененный исходный фермент начинает катализировать новую реакцию, известную для другого фермента, и между обоими ферментами имеет место высокая гомо-
9 Эстераза он о
сА —^----- >1 + Л
НО
/ярет-Бутилацетат трет-Бутанол Уксусная кислота
ОН
НО'^^'Ч
НОА^->Л
он|
т, 0-R
Глюкозид
Галактозидаза
S •
ОН
НОн^Л + «он он]
Глюкоза ^ Спирт
1
о О ft + RjCOOH нОх^Ч^о-р-х
Оэ Жирная
1-Лизофосфолипид кислота
Рис. 58. Ферментативные реакции, иллюстрирующие три подхода к изменению субстратной специфичности ферментов методами белковой инженерии
1 - устранение стерических препятствий: эстеразы не действуют на третичные спирты;
2 - создание новой активности: галактозидазы могут использовать в качестве субстрата галактозиды, но не глюкозиды;
3 - усиление имеющейся небольшой активности: по сравнению с фосфоли-пазой А1, липазы некоторых микроорганизмов, например, Bacillus sp. или Staphylococcus sp., обладают слабой активностью в отношении snl-групп фосфолипидов
логия. Изменения, при которых исходный фермент начинает использовать с высокой эффективностью субстрат, в отношении которого была отмечена лишь слабая исходная активность, составляют третью группу достижений в этой области. Химические реакции, иллюстрирующие три вышеперечисленных подхода к изменению субстратной специфичности ферментов, представлены на рис. 58.
Первое сообщение, в котором описывалось изменение фермента методом направленной эволюции таким образом, что он начинал метаболизировать субстрат, не распознаваемый ферментом дикого типа, появилось в 1998 г. [310]. В качестве исходного соединения был взят эфир, содержащий гидроксильную группу в положении 3, напоминавший по своему строению один из строительных блоков, участвующих в биосинтезе эпо-
?-2 ФосфолипазаА!
О 9 ^ (быстро)
WO^A^o-p-x Липам
г, Оэ
О (медленно)
Фосфолипид
талонов (недавно выделенных из миксобактерий макроцик-лических поликетидов, обладающих противоопухолевой активностью).
Такое соединение не могло быть использовано в качестве субстрата 20-ю исследованными гидролазами (18 липазами и двумя эстеразами). В то же время близкородственные 3-гидро-ксиэфиры стереоспецифически гидролизовались этими ферментами. Получение специфических продуктов гидролиза помимо чисто теоретического имело практическое значение, так как они могли быть использованы в синтезе эпотилонов. С помощью мутаторного бактериального штамма Epicurian coli XL1-Red (Stratagene) была получена клонотека мутантов эстеразы. Отбор вариантов эстеразы, которые в результате мутагенеза приобрели способность гидролизовать это соединение, проводили на основе изменения цвета колоний, как следствие изменения значений pH, происходившего под действием продукта гидролиза этилового эфира 1 а. Обнаруженные таким образом варианты далее дополнительно исследовали на среде, содержащей производное глицерина 16 в качестве дополнительного источника углерода. В том случае, если мутантный фермент приобретал способность гидролизовать это соединение, освобождавшийся глицерин использовался клетками, что проявлялось в ускоренном их росте и образовании более крупных бактериальных колоний. В результате были получены двойные мутанты исходной эстеразы, которые приобрели требуемую активность, характеризующуюся умеренной стереоспецифичностью. Использование насыщающего мутагенеза в окрестностях обнаруженных мутаций позволило отобрать новые мутанты со значительно более высокой стереоспецифичностью.
Другим примером такого рода явилось создание на основе полипептидной цепи индол-3-глицеролфосфатсинтазы (ИГФС), участвующей в биосинтезе гистидина, нового фермента, обладающего активностью фосфорибозилантранилатизо-меразы (ФРАИ), которая участвует в биосинтезе триптофана

О ОН
Мутант
эстеразы
О ОН
+ Этанол
1а, б
a: R = Н3ССН2~
б: R = НОСН2СН(ОН)СН2-
Предыдущая << 1 .. 175 176 177 178 179 180 < 181 > 182 183 184 185 186 187 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed