Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Воздух
а
Буферный раствор
Буферный резервуар
Проточная кювета
Пробирка с образцом
Рис. 1. Сортировка микрочастиц в проточном цитометре [70]
а - подача анализируемого образца в проточную кювету цитометра. Под давлением, создаваемым сжатым воздухом, буферный раствор и суспензия анализируемых микрочастиц подаются в проточную кювету цитометра; б - основные компоненты сортирующей и оптической анализирующей систем четырехпараметрического проточного цитометра; в - формирование капель в процессе сортировки микрочастиц. Между моментом анализа частицы и приданием капле, ее содержащей, электрического заряда проходит время, достаточное для того, чтобы только одна (или три) капли приобрели заряд и изменили траекторию полета в электрическом поле, создаваемом отклоняющими пластинами; А, - расстояние между центрами соседних капель после их выхода из сопла; г - разделение метафазных хромосом человека с помощью проточной цитометрии [71]
Интенсивность флуоресценции (Хёхст 33258)
Область
сортировки
2
13
9-12
18
20
21
14
15
16 17
19
Интенсивность флуоресценции (Хромомицин АЗ)
ный лазерный луч и оказаться равномерно освещенными, что необходимо для их предсказуемой флуоресценции. При этом анализируемые частицы следуют в потоке на некотором расстоянии друг от друга, которое зависит в том числе от их концентрации в анализируемой суспензии. В проточной камере или сразу после выхода из нее микрочастицы облучаются сфокусированным лазерным лучом, и жидкость разбивается на капли, которые приобретают электрический заряд.
Место, где лазерный луч пересекает поток жидкости, называют точкой наблюдения или точкой анализа. Это место окружено линзами, которые собирают свет, испускаемый частицей в результате флуоресценции и составляющий анализируемый сигнал. Световые сигналы попадают на фотодетекторы (фотодиоды или фотоумножители). Фотодетекторы, улавливающие рассеянный свет под прямым углом к лазерному лучу и по его ходу, позволяют оценивать форму и размеры анализируемых частиц, а также их состав (по коэффициенту преломления их внутренней среды) и, как следствие, метаболическое состояние клеток. Длина волны такого рассеянного света соответствует длине волны света, испускаемого лазером. Кроме того, в проточных цитофлу-ориметрах имеется несколько других фотодетекторов, направленных на точку анализа, которые расположены под разными фиксированными углами по отношению к лазерному лучу и снабжены различными оптическими фильтрами. Это позволяет разделять и количественно оценивать излучение, возникающее в результате флуоресценции разных флуорохромов, которыми окрашивают анализируемые микрообъекты. От количества фотодетекторов, окружающих точку анализа, зависит число параметров, которые могут фиксироваться и анализироваться прибором. В соответствии с этим сами приборы могут быть многопараметрическими (обычно пяти-, шестипараметрическими). В фотоде-текторах световые сигналы преобразуются в электрические, которые далее обрабатываются с помощью вычислительной техники. Получив группу сигналов от фото детекторов компьютер в соответствии с заданной программой дает команду о создании электрического потенциала определенной полярности на электродах, которые отклоняют траекторию свободного падения капли жидкости, содержащей микрочастицу, в ту или другую сторону. В результате капля попадает в нужную пробирку, то есть происходит сортировка частиц в соответствии с их свойствами.
Сортировка метафазных хромосом. Один из результатов разделения метафазных хромосом человека с помощью проточной цитометрии представлен на рис. 1, г [71]. В этом опыте суспен-
Таблица 2
Количество индивидуальных хромосом человека, требуемых для реализации разных молекулярно-генетических проектов [72]
Область применения Количество
требуемых хромосом
ПЦР, цитогенетическое окрашивание хромосом 3,0x102
Клонотеки на основе фаговых векторов 1,6 х 106
(размер вставки ~17 т.п.о.)
Клонирование в космидах (размер вставки ~37 т.п.о.) 6,4 х 106
Клонирование в YAC-векторах (размер вставки 6,4 х 107
~100 т.п.о.)
зию метафазных хромосом метили двумя красителями: Хёхстом 33258 и хромомицином АЗ, первый из которых взаимодействует преимущественно с АТ-парами ДНК, а второй - GC-парами. Окрашенные таким образом хромосомы, содержание ДНК в которых может различаться на 50%, разделяли с помощью двухлазерного проточного цитометра. Видно, что в результате сортировки получают фракции всех хромосом за исключением хромосом, относящихся к группе 9-12. В этом конкретном опыте на основании различий в содержании ДНК удалось разделить родительские гомологичные хромосомы 19 и 21 (отмечены стрелками). Хромосомы 9-12, которые не различаются сортировщиком на основании их флуоресценции с вышеупомянутыми красителями, выделяют путем сортировки суспензии метафазных хромосом гибридных клеток хомячок-человек, в которых остается только одна исследуемая хромосома человека (см. ниже).
