Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Другие природные абзимы, обладающие ДНК-никазной и РНКазной активностью, обнаружены в сыворотке крови человека при аутоиммунных заболеваниях (системной красной волчанке) и инфекциях вирусом гепатита В [292, 293]. С использованием разных тРНК в качестве субстратов было установлено, что такие абзимы не обладают специфичностью в отношении последовательностей нуклеотидов, но распознают особенности пространственной структуры этих макромолекул. По-видимому, ДНК-никазные антитела по своей природе являются антиидиотипиче-скими и структура их активного центра имитирует активный центр соответствующих нуклеаз [294, 295]. В организме больных астмой были выявлены аутоиммунные антитела, специфически расщепляющие эндогенно образующийся пептидный гормон -вазоактивный кишечный пептид (VIP), и действие этого абзима, вероятно, вносит существенный вклад в развитие патологического процесса [296]. Тяжелые формы гемофилии могут возникать
вследствие образования аутоиммунных каталитических антител, расщепляющих фактор VIII [297].
Все приведенные примеры каталитических антител, как природных, так и получаемых с помощью белковой инженерии, не являются исчерпывающими и лишь иллюстрируют эту активно развивающуюся область исследований. Полную информацию по данному кругу вопросов можно, в частности, получить из обзоров, недавно опубликованных в ноябрьском номере J. Immunol. Methods за 2002 г., который целиком посвящен абзимам. Сколько же потенциальных ферментативных активностей заключено во всей популяции антител одного индивидуума, репертуар которых практически безграничен благодаря запрограммированному процессу соматического мутагенеза? Насколько общим явлением могут быть побочные ферментативные активности белков, возникающие в результате соматических мутаций в живом организме? Попытка дать ответ на эти вопросы будет предпринята ниже в разделе о ксенобиозе.
3.5. Пептидные аптамеры
Пептидные аптамеры представляют собой искусственно полученные короткие 15-30-звенные аминокислотные последовательности, встроенные генно-инженерными методами в полипептидную цепь белка-носителя, которые обладают способностью специфически распознавать и взаимодействовать с высоко- или низкомолекулярными соединениями. В качестве белка-носителя, чаще всего, используют бактериальный тиоредоксин [298], однако в последнее время разработаны аналогичные системы на основе зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [299] и нуклеазы стафилококков [300]. Таким образом, пептидные аптамеры представляют собой гибридные белки, в которых полипептидная цепь белка-носителя выполняет скелетную функцию, обеспечивая правильное пространственное расположение пептида-рецептора на поверхности белковой глобулы носителя, а также стабильность пептида и высокий уровень его экспрессии во внутриклеточном окружении.
Пептидным аптамерам присущи некоторые черты антител: пептидная часть гибридного белка является аналогом вариабельного участка полипептидных цепей иммуноглобулинов, кроме того, похожей является и функциональная нагрузка на эти два класса макромолекул - и те и другие обладают свойствами высокоспецифических белков-рецепторов с константами диссоциации комплексов с лигандами (Kd) в пределах 10~7—10~8 М. Пептидные
аптамеры получают путем скрининга комбинаторных пептидных клонотек как in vitro с помощью рибосомного и мРНК-дисплея, так и непосредственно в живой клетке в дигибридных системах. Отобранные по способности взаимодействовать с иммобилизованными молекулами, пептидные аптамеры могут специфически распознавать не только белки, относящиеся к одному семейству, но и менее значительно различающиеся аллельные варианты полипептидов.
Экспрессия пептидных аптамеров в клетках позволяет специфически подавлять функционирование белков-мишеней. Такой подход является альтернативой генному нокауту и антисмысло-вым олигонуклеотидам в исследовании функций белков in vivo. Кроме того, с помощью пептидных аптамеров удается блокировать пролиферацию эукариотических клеток, а также прекращать бактериальную и вирусную инфекции. Например, пептидные аптамеры к циклин-зависимой киназе Cdk2 предотвращают ее взаимодействие со своими субстратами и после их синтеза в клетках человека, йрепятствуют прохождению клеток по клеточному циклу [301]. Имеется достаточно примеров, указывающих на то, что внутриклеточная экспрессия пептидных аптамеров специфически нарушает белок-белковые взаимодействия и может изменять внутриклеточную локализацию белков, что часто сопровождается доминантным фенотипическим эффектом [302]. Такого рода соображения стимулировали исследования с использованием пептидных аптамеров для контроля передачи сигналов в клетках человека и животных и разработку на основе аптамеров лекарственных препаратов, обладающих противоопухолевой активностью [303].
Созданы системы отбора пептидных аптамеров, обладающих бактерицидным действием, которые основаны на экспрессии последовательностей пептидных клонотек в бактериях. В этом случае отбираются пептиды с бактерицидным действием только в присутствии индуктора транскрипции гена пептидного аптамера в векторе, который находится непосредственно в бактериальной клетке [304]. Исследование механизмов бактерицидного действия аптамеров, полученных в результате такого скрининга, показало, что их мишенью могут быть конкретные ферменты (тимидилатсинтаза), в том числе участвующие во внутриклеточных процессах, связанных с ростом клеток. В последнем случае пептидные аптамеры служат инструментом поиска новых мишеней, воздействие на которые останавливает рост бактериальных клеток и вызывает их гибель. Пептидные аптамеры, взаимодействующие с онкобелком Е6 вируса папилломы человека,
