Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 178

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 172 173 174 175 176 177 < 178 > 179 180 181 182 183 184 .. 221 >> Следующая

ния химического оружия [284]. Такого рода примеры указывают на чрезвычайно широкий потенциал каталитических антител как искусственных биокатализаторов химических реакций.
Как следует из вышеприведенной схемы получения абзимов, иммунизация экспериментальных животных является основным этапом, определяющим их специфичность. В настоящее время разработаны методы иммунизации, которые позволяют получать каталитические антитела, реализующие механизмы кислотного, основного или ковалентного катализа. Так, использование для иммунизации гаптенов, содержащих положительно заряженные группы, например четвертичные амины, как правило, сопровождается включением в активный центр абзима отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Glu, Asp), а для гаптенов с отрицательно заряженными группами наблюдается обратная картина [285]. Иммунизация гаптенами, которые ковалентно взаимодействуют с аминокислотными остатками центра связывания антител, приводит к образованию каталитических антител, содержащих в активном центре нуклеофильные аминокислотные остатки (Lys, Ser), которые участвуют в реакциях ковалентного катализа [286]. Такая схема иммунизации позволяет получать аб-зимы, осуществляющие специфический гидролиз ароматических эфиров [287].
С помощью клонотек последовательностей, кодирующих Fab-фрагменты или scFv-фрагменты антител, и всего арсенала методов направленной эволюции белков удается осуществлять продуктивный поиск каталитических антител требуемой специфичности (величины ккат/Км) с последующим повышением эффективности катализа для производных этих абзимов в последовательных циклах отбора, имитирующих аффинное созревание антител [288]. Как уже отмечалось выше, использование фаговых и рибосомных дисплеев в направленной эволюции белков дает ряд преимуществ по сравнению с классической гибридомной технологией. Во-пер-вых, эта группа методов дает возможность работать с репертуаром иммунной системы человека и получать абзимы на основе его иммуноглобулинов, что облегчает их последующее внедрение в клиническую практику. Во-вторых, использование клонотек большого размера в принципе позволяет вовлекать в циклы отбора последовательности, не существующие в природе. Наконец, эти подходы исключают необходимость иммунизации животных, а следовательно с их помощью конечный результат может быть получен быстрее и с меньшими затратами.
Рациональный дизайн также способен приносить плоды при конструировании абзимов с заданными свойствами [289]. Была
поставлена задача методами белковой инженерии на основе иммуноглобулинов, специфически взаимодействующих с динитро-фенильными группами антигенов, получить абзимы, гидролизующие эфиры динитрофенола следующей структуры:
О
Исходя из того, что имидазол действует в качестве нуклеофильного катализатора при гидролизе карбоксиэфиров в водных растворах, предполагали, что введение остатка гистидина в центр связывания динитрофенильных лигандов иммуноглобулина может придать ему способность осуществлять гидролиз сложных эфиров динитрофенола. В качестве исходного белка при конструировании абзима использовали VL- и Ун-фрагменты тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, специфически взаимодействующего с динитрофенильными группами антигенов. Фрагмент ДНК, кодирующий Уь-область легкой цепи, синтезировали in vitro и экспрессировали в клетках Е. coli. При этом в процессе синтеза кодон, кодирующий Туг-34, был изменен на кодон His, так как было известно, что именно Туг-34 контактирует с молекулами динитрофенола в комплексах антиген-антитело. Очищенный рекомбинантный Уь-фрагмент объединяли с Ун-фраг-ментом тяжелой цепи природного иммуноглобулина, взаимодействующего с динитрофенолом, что приводило к образованию Fv-фрагмента.
Оказалось, что мутантный Fv-фрагмент способен катализировать гидролиз кумаринового эфира 5-(2,4-динитрофенил)ами-нопентаноевой кислоты (п = 4) в 90 ООО раз более эффективно, чем 4-метилимидазол, и начальная скорость гидролиза была в 45 раз выше, чем у Fv-фрагмента дикого типа. При этом мутантный Fv-фрагмент был неактивен в отношении аминопропаноево-го (п = 2) и аминогексаноевого (п = 5) аналогов субстрата. Таким образом, с помощью замены единственной аминокислоты в анти-генсвязывающем центре иммуноглобулина удалось создать на его основе высокоспецифичный гидролитический фермент, а сам процесс конструирования был основан на знании молекулярных механизмов катализа и взаимодействия антигенов с антителами.
Природные каталитические антитела. В настоящее время неясно, имеет ли гигантский каталитический потенциал антител ка-
кое-либо физиологическое значение для организма животных. Недавно у всех исследованных молекул иммуноглобулинов независимо от их происхождения и специфичности в отношении антигенов была обнаружена способность синтезировать перекись водорода из синглетного кислорода (^2) [290]. Авторы предполагают, что эта ферментативная активность антител может иметь непосредственное отношение к их основной защитной функции [275]. Известно, что антимикробное действие полиморфноядерных лейкоцитов сопряжено с обсазованием активных форм кислорода - супероксид аниона (Ог ), перекиси водорода, 102, радикалов гидроксила (НО») и других сильных окислителей, синтез которых происходит в ответ на интернализацию микроорганизма, покрытого антителами, и его поглощение фагосомами лейкоцитов. В этой связи полагают, что антитела после попадания в фагосомы могут принимать участие в синтезе Н202 и, соответственно, в разрушении патогенного микроорганизма. Антитела оказались уникальными в том отношении, что способны синтезировать до 500 ^юлярных эквивалентов Н202 из 102 без потери активности, тогда как другие исследованные белки синтезируют в тех же условиях <10 молярных эквивалентов или не образуют перекиси водорода вообще [291]. Таким образом, природные антитела, по-видимому, сами по себе обладают всеми свойствами “магической пули”, так как сочетают в себе способность к специфическому распознаванию объекта воздействия со способностью генерировать токсическое вещество, разрушающее этот объект.
Предыдущая << 1 .. 172 173 174 175 176 177 < 178 > 179 180 181 182 183 184 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed