Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Принципы получения каталитических антител и их ферментативная активность. Современные представления о механизмах ферментативного катализа основываются на теории переходного состояния, главные положения которой были сформулированы Л. Полингом [99], а в термодинамических терминах - М. По-лани в 1920-х гг. В соответствии с этой концепцией образование фермент-субстратного комплекса сопровождается конформаци-онными и структурными перестройками субстрата, значительно понижающими энергетический барьер, который необходимо преодолеть для превращения субстрата в продукт реакции. Такое временное нестабильное состояние субстрата в фермент-субст-ратном комплексе получило название переходного состояния. Исходя из этих представлений, можно заключить, что активные центры ферментов в ходе эволюции были сформированы таким образом, чтобы обеспечивать не только связывание субстратов, но и их фиксацию в промежуточном активированном - переходном - состоянии. В настоящее время установлена структура многих субстратов в переходном состоянии и осуществлен химический синтез их стабильных аналогов (transition state analogue -TSA), которые активно используются для получения эффективных ингибиторов ферментов.
Молекулы антител напоминают ферменты по их способности образовывать с высокой специфичностью прочные комплексы с низкомолекулярными гаптенами и антигенными детерминантами больших макромолекул. Однако, поскольку в отличие от ферментов в функции антител не входит дальнейший метаболизм антигена (аналога ферментного субстрата), его перестрой-
Дизайн и синтез аналога субстрата в переходном состоянии (TSA)
Получение конъюгата TSA с белком-носителем
Экспрессия генов фраг Спленэктомия Иммунизация
Фрагменты антител scFv, Fab
Получение
гибридом
Моноклональные
антитела
Очистка
сыворотки
Поликлональные
антитела
Отбор по связыванию с TSA
О (бор ант ител-катали ш оров исследуемой реакции
Рис. 57. Основные этапы получения каталитических антител (абзи-мов) [279]
ка с образованием переходного состояния не происходит. Исходя из этих данных, Р.А Лернер и П.Г. Шультц решили получить антитела путем иммунизации экспериментальных животных стабильными аналогами субстратов в переходном состоянии. При этом предполагалось, что сайты связывания антител, оптимально соответствующие структуре субстрата в переходном состоянии, будут взаимодействовать с самим субстратом, фиксировать, как и фермент, субстрат в переходном состоянии и тем самым ускорять (катализировать) протекание химической реакции в нужном направлении, то есть выполнять ферментативные функции.
Современная схема получения абзимов на основе аналогов субстратов в переходном состоянии (TSA) представлена на рис. 57 [275]. Работа начинается с выбора реакции, которую необходимо осуществить с помощью каталитических антител, далее следует разработка структуры стабильных TSA и их химический синтез. Для повышения иммуногенности низкомолекулярных TSA получают их конъюгаты с высокомолекулярным носителем, например БСА, которыми иммунизируют лабораторных животных. Селезенку иммунизированных животных после спле-нэктомии можно затем использовать для получения поликлональных и/или mAb к TSA по гибридомной технологии и/или для выделения TSA-связывающих фрагментов антител с применением методов фагового или рибосомного дисплеев. На заключительном этапе среди представителей антител, взаимодействующих с TS А, отбирают макромолекулы, катализирующие исследуемую ферментативную реакцию.
Такая схема, получившая название стабилизации переходного состояния, оказалась очень продуктивной. Вначале усилия исследователей были сконцентрированы на хорошо изученных реакциях, в том числе переносе ацильных групп, и была продемонстрирована возможность осуществления таких химических превращений абзимами [276]. При этом типичное ускорение реакции достигало значений в 103-106. Вскоре были получены каталитические антитела, катализирующие химические реакции, трудноосуществимые с помощью обычных химических методов, в частности, анти-Болдуиновская циклизация [277], и гидролиз ВАС2-карбоматного эфира [278]. Кроме того, абзимы, полученные методами белковой инженерии, могут осуществлять реакции, которые не катализируются природными ферментами, что было использовано для избирательной активации предшественников токсических веществ при химиотерапии онкологических заболеваний [279, 280]. Продемонстрирована возможность применения каталитических антител для проведения реакций, сопровождающихся образованием высокореакционноспособных промежуточных соединений: карбокатионов [281], 1,3-диполей [282] и трип-летных бирадикалов [283]. С помощью абзимов удается осуществлять контроль хиральности химических соединений, участвующих в реакциях, при проведении которых такие искусственные ферменты демонстрируют высокую энантио- и диастереоспецифичность. Недавно продемонстрирована возможность получения абзимов, гидролизующих токсичные фосфорорганические соединения, в связи с чем обсуждается возможность их использования в качестве антидотов для ликвидации последствий примене-
