Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Вторичные клонотеки, используемые для осуществления “аффинного созревания” рекомбинантных антител. Имеются задачи, для решения которых аффинность рекомбинантных антител, получаемых с помощью описанных выше первичных клонотек, является слишком низкой. С целью дальнейшего улучшения их характеристик проводят процедуру, получившую название “аффинного созревания”. Для этого новые раунды отбора осуществляют среди последовательностей новой, целиком синтетической клонотеки, полученной на основе последовательностей антител с лучшими характеристиками, которые были выявлены в результате селекции первичной клонотеки.
Для реализации этого подхода прежде всего следует выбрать молекулу рекомбинантного иммуноглобулина, характеристики которого необходимо улучшить. Далее конкретные участки последовательности нуклеотидов, кодирующей выбранное антитело, изменяют с помощью насыщающего мутагенеза, а молекулы антител, которые образуются в результате экспрессии мутантных последовательностей, отбирают по выбранным критериям. Антитела с наивысшей аффинностью (KD 10-100 рМ) были получены из клонотек мутантов по области CDR3 тяжелых и легких цепей молекулы иммуноглобулина, а также других CDR-последо-вательностей, которые формируют центр связывания антигенов [260, 261]. В ряде случаев удается значительно улучшить аффинные характеристики антител, изменяя с помощью случайных мутаций всю V-область исходного фрагмента иммуноглобулина, что напоминает механизм соматического гипермутагенеза при созревании В-клеток. При таком подходе фаги, полученные в каждом цикле отбора, размножали в клетках мутаторного штамма Е. coli mutD5, что позволяло работать с клонотеками очень большого размера (~10и фаговых частиц) [262]. В результате аффинность исходных антител к гаптену удавалось повысить более чем в 100 раз.
Фаговый дисплей. Отбор рекомбинантных антител на основе фагового дисплея является одним из наиболее популярных методов получения антител требуемой специфичности. В этом случае
нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, чаще всего, в формате scFv, объединяют с 5'-концевой частью гена 3 белка оболочки бактериофага fl в составе фаговой хромосомы [263] или фагмиды [260, 264-267]. Существует также клонотека более протяженных последовательностей, кодирующих Fab-фрагменты антител [266]. Источниками последовательностей служили как ДНК периферической крови человека, так и рекомбинантные гены, в которых разнообразие создавалось с помощью вырожденных синтетических нуклеотидов стандартными генно-инженерными методами. Фаговые частицы таких клонотек экспрессировали на поверхности вириона разные аминокислотные последовательности иммуноглобулинов, объединенные с белком оболочки в составе гибридной молекулы. Теоретически подобные клонотеки могут состоять из 1011 разных фаговых частиц, что определяется верхним пределом эффективности трансфекции бактериальных клеток векторной ДНК. Однако возможность осуществления случайной рекомбинации последовательностей первичной клонотеки между собой с помощью сге-рекомби-назы или ПЦР позволяет значительно расширить представительность итоговой клонотеки [268].
Отбор фаговых частиц, экспрессирующих антитела требуемой специфичности, как правило осуществляется с помощью отдельных антигенов, иммобилизованных на твердом носителе с использованием 96-луночных плашек для микротитрования и стандартного иммуноферментного метода [269]. Разработаны и высокопроизводительные методы скрининга с применением микроматриц антигенов, иммобилизованных на мембранах [269]. Сам отбор проводят в виде двух-трех последовательных раундов, каждый из которых включает сорбцию фаговых частиц, экспрессирующих соответствующие антитела, на носителях с иммобилизованным антигеном, отмывку несвязавшихся частиц, элюирование оставшихся связанными и размножение полученных рекомбинантных бактериофагов.
Несмотря на простоту идей, лежащих в основе получения рекомбинантных антител с использованием фагового дисплея, его реализация на практике (как впрочем и любой другой искусственной генетической системы) требует учета массы весьма существенных деталей. В частности, антигены, применяемые в такой системе, должны быть высокоочищенными; полученные с помощью фагового дисплея антитела часто не взаимодействуют с нативными белками; эффекты авидности могут затруднять отбор высокоаффинных клонов; разные клоны с одинаковой аффинностью трудно дифференцировать друг от друга и т.д. [270-272].
3.4.3. Антитела, обладающие ферментативной активностью:
абзимы
В 1986 г. двумя группами исследователей, руководимых Р.А. Лернером и П.Г. Шультцем, было показано, что молекулы антител могут обладать ферментативной активностью [273, 274]. С этого времени берет начало новое направление белковой инженерии по искусственному конструированию ферментов на основе полипептидных цепей иммуноглобулинов, которые получили название каталитических антител или абзимов. Более того, вскоре после этого открытия в организме человека были обнаружены абзимы, появление которых ассоциировано с некоторыми распространенными заболеваниями. Результаты данных исследований еще раз подчеркивают плодотворность рационального подхода к решению проблем белковой инженерии, который по мере углубления знаний о механизмах функционирования белковых молекул, несомненно, станет доминирующим.
