Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Клонотеки, полученные на основе генетического материала доноров с выраженным иммунным ответом (иммунные клонотеки), являются источником получения высококачественных антител, которые могут быть использованы для профилактики заболеваний, иммунотерапии, а также исследования особенностей гуморального ответа пациентов. В этом случае донорами являются пациенты с инфекционными [249], онкологическими [250] и аутоиммунными [251] заболеваниями. В таких клонотеках последовательности, кодирующие антитела с требуемой специфичностью, составляют ощутимую фракцию, а следовательно требуемые антитела с высокой аффинностью могут быть получены уже из клонотек, содержащих ~105 клонов. Кроме того, многие гены этих клонотек кодируют зрелые (affinity matured) антитела, оптимизированные в отношении аффинности, тогда как для получения аффинно-зрелых антител из синтетических клонотек требуется проведение специальной стадии для осуществления их “созревания” (affinity maturation) (см. ниже).
К недостаткам иммунных клонотек следует отнести невозможность осуществления контроля за иммунным ответом, что в ряде случаев исключает получение антител с требуемыми характеристиками. Механизмы природной толерантности, как правило, не допускают получения антител к антигенам организма-до-нора. Помимо всего прочего, токсичность некоторых антигенов (и антител) может стать причиной смерти иммунизируемого организма. При использовании в качестве доноров ДНК пациентов с иммунным ответом обычно в дело идут только мало представленные плазматические и В-клетки, а другие лимфоидные ткани, которые могли бы быть более богатым источником исходного биоматериала, недоступны. Кроме того, для получения антител к каждому новому антигену требуется создание новой клонотеки последовательностей.
Клонотеки, получаемые на основе ДНК неиммунизирован-ных доноров (,неиммунные клонотеки), имеют целый ряд преимуществ перед только что рассмотренными. В этом случае клонотеки получаются значительно более представительными, так как теоретически в них можно обнаружить все возможные варианты антител данной специфичности, и для отбора требуемых клонов можно продуктивно использовать существенно большее количество антигенов, в том числе и аутоантигены.
Однако, как это часто бывает в жизни, упомянутое достоинство при рассмотрении под другим углом зрения становится недостатком таких систем. Из-за больших размеров клонотеки заметно усложняется сам процесс скрининга, а представленность последовательностей в клонотеке становится неконтролируемой и непредсказуемой.
В качестве источников ДНК при конструировании неиммунных клонотек применяют В-клетки различных лимфоидных тканей: периферической крови, костного мозга, тонзилл [252]. При этом для синтеза кДНК, содержащих Ун-последовательности, используют IgM-мРНК или суммарную мРНК соответствующих тканей. Представленность последовательностей в клонотеках, полученных на основе IgG-мРНК, сильно смещена в сторону антител неизвестного происхождения, как результат неконтролируемого иммунного ответа на неизвестные антигены, и такие клонотеки рассматриваются как нерепрезентативные [248]. Из общих соображений следует, что более представительные клонотеки позволяют получать к конкретному антигену более разнообразные антитела с большей аффинностью. Так, из клонотеки, содержащей 1010 клонов, удается получать антитела со сродством 10"8 - 0,3-10"9 М, те же параметры для наилучших антител из клонотек, насчитывающих 3-107 клонов, составили только 10-5-10-7 М [248, 252].
Клонотеки на основе синтетических последовательностей V-генов. В отличие от клонотек, составленных на основе природных последовательностей, “синтетические” клонотеки позволяют использовать весь потенциал генной и белковой инженерии при их конструировании и дальнейшем применении. Первые клонотеки такого рода были построены на основе 49 Ун-сегментов генома человека клеток зародышевой линии, которые собирали случайным образом в полные V-гены с помощью ПЦР, что имитировало V-D-J-рекомбинацию, происходящую in vivo в процессе созревания генов иммуноглобулинов. Это приводило к появлению Ун-генов, кодирующих иммуноглобулины со случайной или частично случайной последовательностью из 4-15 а.о. в CDR3-области. Такие Ун-гены объединяли в одну последовательность с одной из семи Уь-последовательностей, претерпевших перестройки в природных условиях. В подобных клонотеках удалось обнаружить последовательности, специфичные в отношении многих антигенов, но соответствующие антитела обладали низкой (микромолярной) аффинностью [253-256].
В клонотеках большего размера (6,5 • 1010 клонов), при получении которых Ун- и Уь-последовательности объединяли в век-
торе с помощью 1ох-Сге-рекомбиназы in vitro, удавалось обнаруживать гены, кодирующие антитела с аффинностью до 1нМ, что соответствует характеристикам антител, образующихся у мышей во время вторичного иммунного ответа [257]. В целом, использование ряда последовательностей иммуноглобулинов в качестве скелетных, в которых определенные участки систематически изменяют с помощью мутагенеза in vitro, позволяют получать новые антитела с хорошими характеристиками [258, 259].
