Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
претерпевший перестроек в результате рекомбинации в процессе эмбриогенеза). Эта рекомбинантная ДНК была использована далее для получения трансгенных мышей стандартным методом. Анализ таких трансгенных мышей показал, что их геном содержит 34 функционально активных V-гена тяжелых цепей, все их D- и J-гены, а также участок геномной ДНК в эмбриональной конфигурации, фланкированный последовательностями, кодирующими константные области тяжелых цепей С|1 и С8. Трансгенный локус легких к-цепей включал 18 функционально активных V-генов, все J-гены и константную область гена С к.
Основной характеристикой рекомбинантных антител является их специфичность в отношении конкретных антигенов. Однако, кроме этого, они должны обладать способностью выполнять эффекторные функции, обеспечиваемые их константными областями. В классе IgG иммуноглобулинов человека имеются четыре подкласса (изотипа) IgGl-IgG4, которые различаются по способности взаимодействовать с Fc-рецепторами на поверхности эф-фекторных клеток (макрофагов и нормальных киллеров), а также по способности фиксировать комплемент. В зависимости от задач, которые предполагается решать с помощью рекомбинантных антител, предпочтительными оказываются антитела определенного изотипа. Так, если с помощью антител предполагается непосредственно элиминировать клетки-мишени (например, опухолевые клетки), то предпочтительными оказываются антитела изотипа IgGl, так как они эффективно взаимодействуют с Fc-рецепторами и фиксируют комплемент, что необходимо для мобилизации вышеупомянутых клеток-киллеров. Если же антитела будут использованы только для предотвращения взаимодействия лигандов с рецепторами, то антитела должны принадлежать к изотипам IgG4 или IgG2. С учетом этих соображений было получено несколько линий трансгенных мышей, каждая из которых продуцировала антитела человека определенного изотипа.
Ферментативная система мышей, обеспечивающая рекомбинацию частей генов иммуноглобулинов в эмбриогенезе и в процессе иммунного ответа, оказалась полностью совместимой с генами иммунной системы человека. У трансгенных мышей происходило переключение классов иммуноглобулинов человека, а также имел место соматический гипермутагенез. Поскольку единственными белками человека, которые синтезировались в организме трансгенных мышей, были рекомбинантные иммуноглобулины, их организм сохранял способность образовывать антитела на любой антиген человека. Такие трансгенные мыши могли быть использованы для получения гибридом и шАЬ по
стандартной технологии, рассмотренной выше. В течение двух-четырех месяцев у исследователей была возможность создавать панель mAb требуемой специфичности со сродством к антигенам в пределах 10—1000 пМ. Первыми по этой технологии были получены mAb к интерлейкину 8, которые были использованы в клинических испытаниях для лечения псориаза. Время по-лужизни антител в кровотоке пациентов составило ~3 недели, что соответствовало стабильности обычных антител человека. Кроме того, ни у одного больного не наблюдали образования антител к использованному иммуноглобулину. Также успешно проходят клинические испытания антител к рецепторам эпидермального фактора роста, сверхэкспрессия которого имеет место при многих видах онкологических заболеваний.
Рекомбинантные многовалентные антитела. Природные антитела являются многовалентными молекулами, обладающими несколькими идентичными участками связывания антигена. Такое строение антител значительно повышает их функциональную аффинность (авидность), так как позволяет одновременно связываться несколькими участками с одной или многими молекулами антигена и затрудняет диссоциацию иммунных комплексов. Иммуноглобулины класса IgG являются двухвалентными молекулами с двумя антигенсвязывающими Fab-участками полипептидных цепей. В то же время молекулы IgM в физиологических условиях являются пентамерами, обладают 10 Fab-участка-ми, и им свойственна более высокая авидность, чем антителам класса IgG. Кроме того, несмотря на конформационную гибкость молекул IgG, они часто бывают не в состоянии взаимодействовать с соседними рецепторами на поверхности клетки, что, как правило, необходимо для специфической активации внутриклеточной передачи сигналов и апоптоза. Этого недостатка лишены полученные с использованием поперечных сшивок многовалентные антитела [218]. Однако такие многовалентные молекулы иммуноглобулинов обладают слишком большой молекулярной массой (>300 кДа), что затрудняет их проникновение к клеткам-мишеням, например, опухолевым клеткам. Следуя данной логике, можно сформулировать задачу для белковой инженерии: необходимо повысить авидность антигенсвязывающей молекулы на основе иммуноглобулинов за счет увеличения ее валентности, т.е. числа антигенсвязывающих модулей, на фоне одновременного уменьшения молекулярной массы [219]. Исследования, проведенные в этом направлении, не замедлили принести свои плоды.
Антигенсвязывающие модули полипептидных цепей иммуноглобулинов Fab и Fv моновалентны. Модуль Fv построен из
расположенных рядом друг с другом вариабельных частей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина VH и VL, наименьших фрагментов молекулы иммуноглобулина, которые еще могут полностью сохранять антигенсвязывающие свойства исходной молекулы. Исходя из этого, прежде всего, были получены химическими методами двухвалентные и трехвалентные Fab-фрагменты иммуноглобулинов, молекулярная масса которых (60-120 кДа) соответствовала задачам их доставки к клеткам-мишеням [220, 221] (рис. 55,6).
