Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
При использовании большинства методов выделения ДНК из тканей животных происходит одновременное выделение геномной и митохондриальной ДНК. Последняя, как правило, присутствует в клетках в виде множественных копий, что приводит к высокой представленности митохондриальных генов в полученных препаратах ДНК и в клонотеках, создаваемых на основе этих препаратов. В случае необходимости, для освобождения от митохондриальной ДНК на первых стадиях очистки геномной ДНК получают ядра клеток анализируемых тканей. Альтернативно, при необходимости выделения чистой митохондриальной ДНК вначале получают эти органеллы [65].
Электрофоретическое и хроматографическое разделение нуклеиновых кислот. Для дополнительной очистки плазмидной ДНК иногда применяют гель-фильтрацию на Сефакриле S1000 (крупнопористый синтетический аналог сефадекса) [66], а также электрофорез в агарозном геле. Следует отметить, что электрофорез в агарозном, полиакриламидном или смешанном агарознополиакриламидном гелях используют для определения размеров и выделения небольших фрагментов дцДНК, образующихся при
действии эндонуклеаз рестрикции или во время секвенирования ДНК. Проявление фрагментов в этом случае проводят с помощью бромистого этидия, интеркалирующего между основаниями ДНК и флуоресцирующего в ультрафиолетовом свете. Более чувствительными методами обнаружения фрагментов ДНК в гелях являются окраска солями серебра, авторадиография и введение флуоресцентной метки.
Отдельно следует упомянуть метод аффинной хроматографии на олиго(с1Т)-целлюлозе, используемый для специфической очистки эукариотических мРНК, большинство из которых содержит на З'-конце поли(А)-последовательность. В оли-го(я?Г)-целлюлозе последовательности олигоО^Г)^.^ ковалентно присоединены к молекулам целлюлозы своими 5'-концевы-ми фосфатными группами. При использовании этого метода фракцию суммарной РНК наносят на колонку с олиго(я?Г)-цел-люлозой в условиях, при которых происходит гибридизация по-ли(А)-последовательностей мРНК с комплементарными им последовательностями олиго(я?Г)-целлюлозы. После отмывки не-связавшихся со смолой молекул РНК, большинство из которых являются рРНК и тРНК, фракцию поли(Л)-РНК элюируют, прогревая колонку до температуры плавления поли(Л)»оли-го(я?7)-гибридов или разрушая гибриды понижением ионной силы элюирующего раствора.
Перечисленные выше способы очистки и фракционирования нуклеиновых кислот позволяют получать лишь относительно короткие последовательности нуклеотидов. Однако в настоящее время в арсенале молекулярной биологии имеются методы, которые дают возможность выделять в гомогенном состоянии последовательности нуклеотидов, эквивалентные целым хромосомам. Одним из таких методов является электрофорез в импульсном электрическом поле (pulsed field gel electrophoresis - PFGE), с помощью которого удается препаративно разделять, например, ДНК целых хромосом дрожжей [68, 69]. Другой эффективный метод, с помощью которого можно фракционировать метафаз-ные хромосомы млекопитающих - это сортировка хромосом с помощью проточной цитофлуориметрии [70-72]. Метод позволяет получать индивидуальные метафазные хромосомы в количестве, достаточном для конструирования клонотек генов индивидуальных хромосом.
2.1.2. Выделение метафазных хромосом
с помощью проточной цитометрии
По не вполне понятным причинам природа позаботилась о том, чтобы большие геномы эукариот были разделены на строго определенные сегменты ДНК, расположенные в отдельных хромосомах. Трудно предположить, что при этом учитывались интересы генетиков, хотя такая организация генома, несомненно, облегчает его исследование. Действительно, полное секвенирова-ние и генетическое картирование генома всегда начинается с изучения отдельных хромосом. Ниже будут рассматриваться клоно-теки геномной ДНК, в том числе, и соответствующие отдельным хромосомам исследуемого биологического вида. Для создания таких клонотек, без которых не обойтись при систематическом изучении индивидуальных генов, прежде всего, необходимо получить препараты метафазных хромосом исследуемого биологического вида. Для решения этой непростой задачи в настоящее время успешно используют проточную цитометрию, группу инструментальных методов, специально разработанную для сортировки микроскопических частиц [72]. Для обозначения проточной сортировки клеток и хромосом часто используется аббревиатура FACS (fluorescence-activated cell (chromosome) sorting).
Принцип действия проточных цитофлуориметров-сортиров-щиков. Для фракционирования микроскопических объектов в проточных сортировщиках суспензию частиц метят флуоресцентным красителем и пропускают в струе жидкости через луч лазера. Жидкость, содержащая флуоресцентно меченые частицы, при прохождении через сопло, в результате вибрации его разбивается на капли, содержащие отдельные микрочастицы. Каждая из капель приобретает электростатический заряд. Капли пролетают между двумя электродами, на которые под управлением компьютера подается напряжение, создающее электрическое поле определенной направленности, что приводит к отклонению траектории падения частиц (рис. 1, a-в). Буферный раствор подается из резервуара в проточную кювету, в которой происходит ее смешивание с анализируемыми микрочастицами (до Ю5 частиц на 1 мл суспензии), после чего через сопло диаметром 50-250 мкм суспензия впрыскивается в центральную стационарную часть струи жидкости, называемую коаксиальным потоком, Диаметр которой составляет 5-20 мкм. Частицы захватываются потоком в результате гидродинамического фокусирования и перемещаются вместе с жидкостью. Движение частиц в коаксиальном потоке позволяет им точно попадать далее в сфокусирован-
