Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
рибозилтрансферазы (HPRT) или тимидинкиназы (ТК), необходимых для роста клеток на селективной среде. Гены данных ферментов клетки получают в результате слияния от В-лимфоцитов селезенки. Сами же клетки селезенки сохраняют свою жизнеспособность в культуре в течение 10-14 дней, после чего спонтанно погибают. Суспензию гибридных клеток распределяют по лункам 96-луночных плашек, содержащих в виде монослоя питающие клетки, которые обеспечивают гибридомы факторами роста, необходимыми для их эффективного размножения. В современном варианте культивирования питающие клетки могут быть заменены полноценными питательными средами.
Выращенные таким образом в небольшом количестве культуры гибридных клеток проверяют на способность секретиро-вать в питательную среду специфических антител и далее рассе-вают до отдельных клеток методом последовательных разведений. В результате, каждая клетка потенциально может стать родоначальницей клона, продуцирующего mAb требуемой специфичности. Поскольку синтез антител в ряде случаев может быть токсичным для клетки-продуцента, вместо культивирования in vitro на этой стадии параллельно используют культивирование in vivo в виде асцитных опухолей у мышей. Отмечено, что непродолжительное культивирование in vivo в дальнейшем способствует стабилизации клеточных линий, продуцирующих mAb. Полученные таким образом, охарактеризованные клоны гибридом являются источником неограниченного количества mAb данной специфичности, которые можно получать, культивируя гибридомы в искусственной питательной среде или асцитной жидкости организма мышей.
Для культивирования гибридом in vitro в основном используют два подхода. При одном из них гибридомы выращивают в течение ~10 дней в виде суспензионных клеточных культур на искусственных питательных средах в присутствии фетальной телячьей сыворотки в качестве источника факторов роста. В ряде случаев гибридомы удается адаптировать к росту в бессыворо-точных средах. Концентрация mAb в таких средах к моменту завершения культивирования достигает ~10 мг/мл. mAb можно сконцентрировать и очистить стандартными хроматографическими методами, включая аффинную хроматографию на колонках с иммобилизованными протеином А или протеином G, однако некоторые антитела не переносят таких манипуляций и дена-турируют, утрачивая свою активность.
Попытки получать mAb in vitro в более высоких концентрациях, не прибегая к специальному концентрированию, привели к
разработке систем культивирования клеток с использованием полупроницаемых мембран для отделения клеток и синтезируемых шАЬ от питающего раствора. В этом случае культура клеток находится в сосуде объемом ~5 мл, отделенном от сосуда с питательной средой большего объема мембраной, поры которой позволяют диффундировать веществам с молекулярной массой 1-30 к Да. Такая система позволяет работать с клетками и шАЬ независимо от питательной среды, а также легко менять ее состав. При этом концентрация антител, синтезируемых в подобных системах, сопоставима с их концентрацией в асцитной жидкости. Особенно высокую плотность клеток в культуре удается получать с использованием биореакторов, в которых питательную среду и газы прокачивают через полупроницаемые капилляры (hollow-fiber bioreactor).
Хотя в клеточных культурах in vitro удается синтезировать более 90% rnAb, в ряде сложных случаев невозможно обойтись без культивирования гибридом в асцитных опухолях. Это особенно относится к трансфектомам - клеточным линиям, полученным в результате трансфекции миеломных клеток векторными молекулами ДНК, экспрессирующими мутантные гены иммуноглобулинов, полученные генно-инженерными методами. Асцитный метод становится незаменимым и в тех случаях, когда необходимо получать в небольших количествах разнообразные концентрированные препараты rnAb, например во время скрининга антител определенной специфичности. Этот метод часто используют для получения rnAb изотипов М и G3 (IgM и IgG3), которые легко денатурируют в процессе очистки, что сопровождается потерей комплементсвязывающей активности, а также IgA-антител. Иногда в клеточных культурах образуются неправильно гликозилированные rnAb, что отрицательно сказывается на их антигенсвязывающей активности и других биологических свойствах.
Эти и некоторые другие ограничения использования для производства rnAb культивируемых гибридом не позволяют полностью отказаться от асцитной жидкости как источника таких белков. Поэтому, несмотря на введение ограничений на вивисекцию экспериментальных животных, культивирование гибридомных клеток in vivo и по сей день остается популярным и в ряде случаев единственным способом, позволяющим добиваться приемлемых результатов в данной области биотехнологии.
Свойства шАЬ. Важнейшими свойствами антител являются их специфичность и аффинность. Аффинность (КА) является термодинамическим параметром, количественно описывающим
силу взаимодействия антигена и антитела в растворе, и определяется по закону действующих масс как отношение концентрации комплекса антиген-антитело к произведению концентраций компонентов. Значения аффинности для mAb лежат в пределах 105-1012 М-1 для высокоаффинных и низкоаффинных соответственно. Общая стабильность комплекса обозначается термином авидностъ, которая определяется аффинностью, валентностью антигена и антитела, а также особенностями пространственной структуры антигена, создающими стерические препятствия для образование комплекса.
