Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
В целом, подходы рационального дизайна и направленной эволюции белков оказываются весьма плодотворными в преодолении пропасти между жесткими требованиями, предъявляемыми к промышленным ферментам, и их реальными биохимическими свойствами. Несомненно, активные исследования в этой области сделают нас в ближайшие годы свидетелями новых достижений.
3.4. Белковая инженерия антител
Антитела, благодаря своей высокой специфичности взаимодействия с высокомолекулярными и низкомолекулярными лигандами различной природы, находят широкое применение в различных областях биологии и медицины. Уникальные свойства антител позволяют использовать их для введения специфических меток и обнаружения макромолекул как in vivo во внутриклеточном пространстве, так и на фиксированных цитологических препаратах, и делают незаменимыми в медицинской диагностике. В виде конъюгатов с токсинами и радионуклидами они находят применение в качестве средства адресной доставки этих соединений к клет-кам-мишеням для их избирательной элиминации в терапевтических целях. Антитела, обладающие ферментативной активностью, обнаружены при некоторых заболеваниях человека, а также являются предметом интенсивных исследований в биотехнологии.
Разработка методов получения в неограниченных количествах mAb заданной специфичности еще больше расширила область применения этих белков. В свою очередь, само появление моноклональных антител (mAb) стимулировало исследователей к применению методов белковой инженерии для направленного изменения исходных макромолекул, что привело к созданию целой группы белков с совершенно новыми свойствами. Получение абзимов, т.е. антител, обладающих ферментативной активностью, явилось одним из самых неожиданных открытий в этой области исследований. Достижения в конструировании антител и их производных хорошо иллюстрируют возможности современной белковой инженерии.
3.4.1. Моноклональные антитела
Поликлональная антисыворотка, полученная в результате иммунизации животного индивидуальным антигеном, содержит целый набор антител, принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов, которые взаимодействуют с разными эпитопами антигена, обладают разной аффинностью и присутствуют в неодинаковых пропорциях у отдельных животных, а также в разные периоды жизни индивидуального организма. Эпитопом (антигенной детерминантой) называют часть молекулы антигена, распознаваемую молекулой антитела или рецептора, специфичного в отношении данного антигена, и взаимодействующую с ним. Как следует из названия, моноклональные антитела (mAb) представляют собой иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном иммортализованных В-лимфоцитов, и представляют со-
бой гомогенную популяцию идентичных белковых молекул одной специфичности [212]. Современные методы получения mAb позволяют целенаправленно нарабатывать белки заданной специфичности, взаимодействующие с конкретными эпитопами молекул-мишеней или определенной группой эпитопов.
Получение mAb. Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb (Г. Колер и С. Милыитейн, 1975 г.), как и всё гениальное, очень проста: сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секре-тирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела.
Для создания перевиваемых линий клеток свежевыделенные лимфоциты селезенки сливают в присутствии фьюзогена (поли-этиленгликоля) с опухолевыми (плазмацитомными или миеломными) лимфоцитами животного в идеале того же вида, которые могут делиться неограниченно долго. Такие иммортализованные клетки должны обладать развитым эндоплазматическим ретику-лумом и не синтезировать иммуноглобулины, кодируемые их собственными генами. Кроме того, эти клетки должны обладать чувствительностью к селектирующему агенту (аминоптерину или азасерину). Гибридные клетки (гибридомы) отделяют от исходных опухолевых клеток на селективной питательной среде HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine), содержащей указанные соединения, включая ингибитор биосинтеза нуклеотидов ами-ноптерин, в которой исходные миеломные клетки не могут делиться и погибают. Это происходит потому, что миеломные клетки не содержат одного из ферментов: гипоксантин-фосфо-
