Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
на с их каталитическими функциями. Методами белковой инженерии было установлено, что термостабильность фермента и его способность катализировать химическую реакцию, по крайней мере, частично не зависят друг от друга, при этом мутации, которые усиливали бы данные свойства, встречаются редко.
Распространенным способом получения экстремозимов является их биосинтез в мезофильных микроорганизмах. В этой связи, уместно вспомнить о нашей работе, завершившейся созданием высокопродуктивного штамма продуцента термостабильной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus YT1 [207]. Ген фермента был клонирован в плазмидном экспрессирующем векторе (см. раздел 4.6 первой части книги) под контролем термоиндуцируемого промотора и введен в клетки Е. coli. Первичная структура гена была адаптирована для его эффективной экспрессии в данной искусственной генетической системе, что потребовало замены двух аминокислотных остатков в N-конце-вой части рекомбинантного фермента. В итоге из 100 г биомассы удается получать до 2 млн единиц активности высокоочи-щенного фермента, который в настоящее время используется многими лабораториями для проведения ПЦР. Благодаря вышеупомянутым заменам, улучшившим потребительские свойства белка, наш фермент содержит еще и фирменную N-конце-вую метку из уникальных аминокислотных остатков, что позволяет при желании легко идентифицировать его среди ферментов других производителей.
Плодотворным подходом в белковой инженерии этого направления является искусственный перенос особенностей первичной и пространственной структур экстремофилов к мезо-фильным аналогам, т.е. использование методов рационального дизайна и редизайна. В частности, введение нескольких мутантных аминокислотных остатков в полипептидную цепь термолизиноподобной протеиназы умеренного термофила Bacillus stearothermophilus позволило в 340 раз повысить стабильность фермента при 100 °С по сравнению с исходным белком со временем полужизни в таких условиях - 170 мин и сохранить неизменной удельную активность фермента [208]. Не удивительно, что этот фермент стал гидролизовать субстраты, устойчивые к действию исходной протеиназы. Как полагают, такие мутации, приводящие к заменам Gly —> Ala и Ala —> Pro, а также образованию новой дисульфидной связи, сопровождаются понижением значений энтропии для денатурированной формы фермента, которая становится из энергетических соображений менее предпочтительной по сравнению с нативной конформацией.
А;
Аг
<
<
- КО 0,8. 0,6-0,4-0,2-
н о
0
1
J3
с; к ю сз н о о S о.
<L>
ь 0,0.
¦ г;."
/*:.. у Лц.:|у ju "*
• . ' V
_______________L*.
Активность (Aj)
I
S
Р
0
чо
S
о.
с
S
1
СО
S
*
с;
о
«
S
о
о.
а
1000
100
10
3-2G7
Насыщающий / мутагенез —'
Л
/
V
Дикий тип
Ход эволюции
Температура (°С)
Рис. 54. Получение термостабильного производного субтилизина из психрофильного гомолога S41 антарктической бактерии рода Bacillus методом направленной эволюции белковых молекул [213]
а - отбор термостабильных производных фермента из библиотеки случайных мутантов проводили путем параллельного переноса мутантов в новые плашки с последующей их инкубацией при комнатной (RT) и повышенной (НТ) температурах и определением оставшейся ферментативной активности мутантов. А; и Аг - удельные активности ферментов при нормальной и повышенной температурах соответственно;
б - термостабильность индивидуальных мутантов и их удельная активность при обычной температуре. Эллипсом обведены точки, характеризующие по исследуемым параметрам разные клоны фермента дикого типа, что позволяет оценить воспроизводимость опытов. Пунктирные линии отмечают усредненные характеристики фермента дикого типа;
в - схема, отражающая термостабильность производных субтилизина, полученных на отдельных этапах направленной эволюции. Применение на заключительном этапе отбора методики случайного объединения сегментов генов разных термостабильных аналогов позволяет повысить их термостабильность еще по крайней мере в 10 раз;
г - зависимость удельной активности от температуры у исходного, мезо-фильного и мутантного термостабильного субтилизина пятого поколения
Методы направленной эволюции белков активно используются для улучшения свойств ферментов, важных для биотехнологии. В качестве еще одного примера изменения термостабильности ферментов с помощью направленной эволюции белковых молекул рассмотрим недавно опубликованный метод получения термостабильного аналога субтилизина из гомолога этого фермента (субтилизина S41) психрофильной (предпочитающей пониженную температуру окружающей среды) антарктической бактерии Bacillus ТА41 [209, 210]. В этом случае клонированный в экспрессирующем векторе ген психрофильного субтилизина мутагенизи-ровали с помощью ПЦР, получая клонотеку последовательностей, содержащих случайные мутации. Отбор термостабильных вариантов клонов проводили при повышенной температуре, достаточной для того, чтобы полностью инактивировать исходный фермент (рис. 54,а). Отношение удельной активности мутантных ферментов в условиях высокой температуры к активности при обычной температуре (AJA,•) использовали в качестве меры для оценки термостабильности мутантов. Одновременно осуществляли мониторинг за термостабильностью отдельных мутантов и их удельной активностью при обычных температурах. Контрольные эксперименты с независимыми клонами фермента дикого типа показали, что ошибка в оценке этих ключевых параметров активности ферментов не слишком высока (рис. 54,6). Один из мутантов с повышенной термостабильностью, полученный в первом раунде отбора, далее модифицировали с помощью насыщающего мутагенеза с последующей оценкой термостабильности новых мутантов (рис. 54,в - отмечены эллипсом). Это позволило увеличить термостабильность исходного мутанта в ~10 раз, а дальнейшее 10-кратное повышение стабильности было достигнуто путем случайного обмена фрагментами мутантных генов ферментов первого поколения. Общий результат направленной эволюции субтилизина представлен на рис. 54,г. Точно так же путем введения случайных мутаций и отбора in vitro удалось существенно повысить термостабильность и удельную активность 3-изопропил-малатдегидрогеназы В. subtilis, которую пришлось, однако, экспрессировать в клетках Thermus thermophilus [211]. Число таких примеров можно без труда увеличить [211].
