Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Считается, что ферменты максимально адаптированы к функционированию в условиях, оптимальных для роста организ-ма-хозяина. Классическим путем получения бактериальных экстремозимов для биотехнологических целей является выделение микроорганизма в виде чистой культуры с последующей очисткой фермента из биомассы, которую обычно выращивают в фер-
ментерах. Альтернативно, из ДНК клеток чистой культуры выделяют ген требуемого фермента и с использованием экспрессирующего вектора клонируют его в бактериальных клетках, удобных для крупномасштабного культивирования, чаще всего в клетках Е. coli. К сожалению, в настоящее время лишь 0,1-1,0% микроорганизмов окружающей среды могут быть выделены и культивированы в чистом виде. Для использования ферментативных ресурсов этих организмов применяют другие подходы. В частности, ДНК, выделяемую прямо из почвы или других объектов окружающей среды, используют для получения так называемых клонотек ДНК окружающей среды (environmental libraries), которые являются неисчерпаемым источником новых генов. Альтернативно с помощью методов белковой инженерии можно модифицировать известные мезофильные ферменты для придания им новых свойств, которые бы позволили ферментам функционировать в экстремальных условиях. Реализация этого подхода требует знаний механизмов, обеспечивающих природным экс-тремозимам их исключительные качества.
Исследование первичной и пространственной структуры экс-тремозинов выявило ряд существенных особенностей их строения, отличающих эти ферменты от мезофильных гомологов. В частности, для ферментов термофилов и гипертермофилов характерно наличие развитой сети внутримолекулярных ионных взаимодействий, в том числе и между субъединицами [202]. Это приводит к формированию у таких ферментов более компактной пространственной структуры. Тем не менее, данный механизм стабилизации термофильных ферментов не является универсальным, и у гомологов различных видов термофилов могут быть задействованы разные механизмы, например, дополнительные гидрофобные взаимодействия вместо ионных. У р-гликозидазы Sulfolobus solfataricus развитая сеть ионных взаимодействий на поверхности молекулы сочетается с наличием гидрофильных каналов, проникающих глубоко в белковую глобулу, что также считается фактором, способствующим стабилизации этого фермента [203]. В целом, в настоящее время еще не установлены универсальные закономерности, определяющие высокую термостабильность ферментов, что само по себе может оказаться общим правилом, указывающим на уникальность каждого стабилизирующего механизма.
В отличие от гипертермофилов ферменты психрофильных микроорганизмов функционируют в условиях низких температур и быстро инактивируются уже при умеренных температурах. Кристаллографическое изучение этих ферментов показывает,
что для них характерна более высокая гибкость полипептидных цепей по сравнению с соответствующими функциональными аналогами мезофильных организмов [204]. Кроме того, защита таких ферментов от денатурации в условиях низких температур частично достигается ослаблением гидрофобных внутримолекулярных взаимодействий в этих условиях.
Экстремозимы галофилов адаптированы к функционированию при высокой ионной силе, поскольку ионные условия внутри клеток данных микроорганизмов изотоничны по отношению к окружающей среде. Например, внутри клеток археи Methanopyrus kandleri, размножающейся при 98 °С, концентрация фосфата достигает 1,5 М [205, 206]. Белки галофильных бактерий являются значительно более кислыми по сравнению с аналогами мезофилов и содержат существенно большее количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков на своей поверхности. Полагают, что эти остатки удерживают гидратирующие ионы у поверхности белковой глобулы, а также, будучи гидрофильными, препятствуют агрегации молекул в условиях высокой ионной силы за счет гидрофобных межмолекулярных взаимодействий. Сети внутримолекулярных взаимодействий также вносят вклад в поддержание особых свойств ферментов этой группы.
У ацидофильных и алкалифилъных экстремофилов, которые существуют при сильно кислых и сильнощелочных значениях pH окружающей среды, условия внутри клеток близки к нейтральным. Тем не менее, внеклеточные ферменты этих микроорганизмов вынуждены функционировать именно в таких условиях и обладают повышенной стабильностью.
3.3.2. Достижения белковой инженерии
в повышении стабильности ферментов
Осмысленное следование законам природы является основой успеха конструирования искусственных генетических систем вообще и новых белков в частности. Попытки использовать знания о механизмах функционирования природных экстремозимов при конструировании белков с помощью рационального редизайна уже приносят определенные плоды. Так, введение в белки дополнительных внутримолекулярных ионных связей путем добавления в полипептидную цепь новых аминокислотных остатков приводит к их стабилизации, хотя часто ценой уменьшения удельной активности [201]. Элиминация же таких связей дестабилизирует ферменты. Конформационная гибкость ферментов тесно связа-
