Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 99

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 140 >> Следующая

В качестве способа растворения одно время довольно широко использовали сжигание биологических препаратов в специальных автоматизированных приборах, например «Oxidizer Model 306» (фирмы «Packard»). Сжигание проводилось при высокой температуре до конца —до образования С02 и Н20. Таким образом, весь 3Н оказывался в составе радиоактивной воды, которую собирали конденсацией, а весь “С — в составе СОа, который полностью захватывался специальным жидким поглотителем («Oxisorb-2» и «Oxisorb-СОг» фирмы «NEN»). После этого две жидкости порознь автоматически смешивали со сцинтилляторами в двух разных флаконах, что позволяло отдельно просчитать компоненты двойной метки препарата. Сейчас метод сжигания используют редко — только в качестве контрольного метода ввиду его абсолютного характера. Прибор дорог, производительность его невелика, а разработанные в последние годы солюбилизаторы конкурируют с ним весьма успешно.
При некоторых биохимических экспериментах возникает необходимость захвата и просчета радиоактивности 14COs (например, при проведении соответствующей ферментативной реакции в колбе Варбурга или при регистрации дыхания подопытного животного). Для этой цели можно использовать фильтр, смоченный р-фенилэтиламином. Образующийся карбонат плохо растворим в толуоле, но хорошо — в метаноле. В виде такого раствора его потом и вносят в сцинтиллятор. Еще полнее поглощает С02 описанный выше солюбилизатор Protosol фирмы «NEN».
Подготовка препаратов к счету
Следует различать два варианта приготовления радиоактивных препаратов на фильтрах для их просчета в жидком сцинтилляторе. Первый —это чисто механическое задержание белков и нуклеиновых кислот после осаждения их кислотой, этанолом или иным способом из реакционной смеси или из разделенных фракций. Для этой цели употребляются кружочки толстой фильтровальной бумаги (например, «Whatman ЗММ») или стекловолок-нистые фильтры типа GF/A-C с размерами пор 0,45—1,2 мкм. Второй вариант —это молекулярная сорбция на мембранных фильтрах из нитроцеллюлозы. Такие фильтры прочно сорбируют многие белки (особенно щелочные), рибосомы, мРНК и однони-тевые молекулы ДНК. Чаще всего употребляют мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, хотя это и не обязательно, поскольку задержание препарата на фильтре обусловлено в этом случае его сорбцией, а не размером молекул или частиц. Из числа наиболее употребительных марок мембранных фильтров можно назвать BA-85 («Schleicher und Schvill», ФРГ), «Millipore НА» или «HAWP» («Millipore», США и Франция), SM-11306 («Sartorius», ФРГ).
Следует отметить важное для счета радиоактивности различие по характеру расположения препаратов между мембранными и бумажными или стекловолокнистыми фильтрами. Сорбированный на мембранном фильтре материал распределен в виде мономолекулярного слоя по поверхности фильтра и поэтому полностью контактирует со сцинтиллятором. В случае использования любого из так называемых «глубинных» фильтров часть материала проникает в глубь фильтра, что может затруднять его контакт со сцинтиллятором. Последнее явление не следует путать с самопоглощением (3-радиоактивности в крупных агрегатах белкового или нуклеинового осадка. Кстати, для задержания осадков можно использовать и мембранные фильтры, хотя это дорого и не сулит преимуществ, поскольку механизм молекулярной сорбции здесь уже роли не играет.
К варианту счета радиоактивности на фильтрах можно отнести просчет полосок или «пятен», вырезанных после проведения хроматографии или электрофореза на бумаге.
Фильтры вырезают или приобретают готовыми в виде кружков диаметром 24—25 мм, что позволяет без труда вносить их во флаконы сцинтилляционного счетчика. Процесс фильтрования ведут с помощью самодельного или фирменного фильтровального устройства (рис. 71). Раствор; содержащий сорбируемые молекулы, или суспензию осадка заливают в верхний резервуар и при небольшом разрежении просасывают через фильтр, который благодаря разъемной конструкции резервуара легко установить и снять со стеклянной пористой подложки.
За любым вариантом задержания исследуемого радиоактивного препарата на фильтре в тех случаях, когда в фильтруемой жидкости есть «лишняя» свободная радиоактивность (например, радиоактивные предшественники синтеза биополимера), следует удаление этой радиоактивности с фильтра путем многократной его промывки. При счете единичных фильтров промывку можно провести в том же фильтровальном устройстве, заполняя его резервуар последовательно 5—6 сменами промывной жидкости, не способной растворить осадок (часто той же, в которой велось осаждение биополимера, например 5%-ной ТХУ или этанола). Промывную жидкость не следует просасывать быстро во избежание образования непромывающихся застойных зон. Для большого числа фильтров такая промывка оказывается слишком трудоемкой и длительной. В этом случае фильтры промывают «в объеме», сразу большими партиями, сменяя промывные жидкости через каждые 15 мин из расчета по 10 мл на один фильтр. Предварительно фильтры нумеруют у края карандашом. Во время каждой промывки жидкость периодически взбалтывают.
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed