Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Многие биологические объекты (клетки и их компоненты, микроорганизмы, а также осажденные из реакционных смесей белки и нуклеиновые кислоты) бывает трудно перевести в водный раствор. Для этого требуется разрушить высшие структуры и зачастую осуществить глубокий гидролиз биополимеров. Такой процесс солюбилизации должен предшествовать счету радиоактивности, если его предполагается вести в растворе, как было описано выше.
Простейший способ солюбилизации — обработка препарата горячим концентрированным раствором щелочи, например 5 М КОН при 70° в течение 1—4 ч. После охлаждения и нейтрализации раствор вносят в толуол-тритоновый сцинтиллятор. Примесь радиоактивного 4®К в КОН обычно не превышает 0,012% —это лишь незначительно увеличивает уровень фона. NaOH для этой цели использовать не рекомендуется, так как образующиеся радиоактивные натриевые соли гораздо хуже растворяются в сцинтилляторе, чем калиевые. Использование для гидролиза концентрированного аммиака дает очень хорошие результаты, но имеется риск образования летучих радиоактивных продуктов и соответствующих потерь радиоактивности с ними. Метод горячего щелочного гидролиза привлекает своей простотой и дешевизной, но растворение не всегда оказывается полным. Белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды можно попробовать растворить в
диметилсульфоксиде. Иногда для солюбилизации биологических препаратов используют энергичное окисление. Например, в смеси, содержащей 60% НСЮ* и 30% Н2Ог, 100 мг животной ткани удается растворить при 70—80° за 1—2 ч.
В настоящее время для солюбилизации широко применяют жирные производные четвертичного аммония, в состав которых входят алкильные заместители, содержащие от 6 до 20 атомов углерода. Это — тоже сильные щелочи, но, в отличие от аммиака^ они не дают летучих продуктов гидролиза и, кроме того, в определенной степени являются детергентами. Именно к этой категории относится уже упомянутый гиамингидроксид. Его обычно используют в виде 1 М раствора в метаноле. 50 мг ткани в 0,5 мл такого раствора растворяются при 45° за 10—24 ч. При растворении сухих препаратов следует предварительно дать им набухнуть в воде. К сожалению, у гиамингидроксида есть существенный недостаток — он вызывает довольно сильное (по сравнению-с другими солюбилизаторами) тушение. В продаже имеется целый ряд фирменных солюбилизаторов такого же типа, например «Soluene-ЮО» и «Soluene-350» фирмы «Packard» или довольношироко распространенный «NCS» («Nuclear Chicago Solubilizer»).
Приведем некоторые фирменные рекомендации по использованию NCS. Для солюбилизации измельченной ткани или ее го-могената (4:1) добавляют шестикратный объем (NCS) и выдерживают при 50° до полного растворения. Для обесцвечивания: гидролизата на каждый 1 мл NCS рекомендуется добавить 0,3 мл перекиси бензоила и подержать еще 30 мин при 50°. Лиофили-зированный препарат следует увлажнить и обработать так же~ При необходимости просчитать водный раствор радиоактивной неорганической соли во избежание ее выпадания в осадок рекомендуется предварительно добавить в сцинтиллятор четырехкратный по отношению к раствору соли объем NCS. Если препарат находится в ПААГ, то для его растворения и элюции и® геля срез последнего толщиной 1—2 мм (<50 мг) помещают во флакон, добавляют туда 0,5—1 мл смеси NCS — вода (9:1) и,, завинтив флакон, выдерживают 2 ч при 50°.
Фирма «Beckman» предлагает солюбилизатор другого типа — «Bio-Solv» (состав точно не известен). Одна из марок этого солюбилизатора (BBS-3) позволяет вводить в толуольный сцинтиллятор раствор радиоактивной соли высокой концентрации,, другая (BTS) предназначена для быстрой (за 3—5 ч) солюбилизации гомогенатов тканей при 55°.
Используемое почти всегда нагревание солюбилизаторов до 50—55° заметно ускоряет растворение, но не следует превышать этот уровень температур из-за развития интенсивной окраски, приводящей к оптическому тушению. С солюбилизаторами всегда используют толуольные сцинтилляторы, так как в диоксано-вых они возбуждают сильную хемолюминесценцию даже в отсутствие препарата. О полноте растворения судят по прозрачности сцинтиллятора.
Фирма «NEN» предлагает также солюбилизатор в виде 0,5 М раствора некоего замещенного четвертичного аммония под торговым названием «Protosol». До 150 мг ткани можно растворить в 1 мл Protosol при 55° за 3—6 ч (или за ночь при комнатной температуре). В случае развития окраски рекомендуется обесцвечивание перекисью водорода (0,1 мл 30% Н„02 на препарат в течение 30 мин при 55°). Затем растворенный препарат вносят в 10 мл Biofluor или Econofluor, энергично встряхивают, дают уравновеситься в течение часа и лишь после этого считают. Иногда во избежание хемолюминесценции в сцинтиллятор добавляют еще 0,5 мл 0,5 н НС1. Отметим, что кислоту следует добавлять только после растворения солюбилизированного препарата в сцинтилляторе. Любопытно, что белки при этом редко выпадают в осадок, хотя их гидролиз не проходит до конца. Вероятно, они защищены от агрегации взаимодействием с солюбилизатором как с детергентом. Следует упомянуть, что обработка препаратов солюбилизаторами типа Soluene и Protosol прямо на нитроцеллюлозных фильтрах приводит к Появлению окрашенных продуктов за счет нитроцеллюлозы. Фильтры из ацетилцеллюлозы окраски не дают.
