Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
При смешивании толуола и Тритона Х-100 их следует подогреть примерно до 45°, а затем в течение нескольких часов выдержать при температуре счета — тогда при малом содержании воды (до 1,4 мл на 10 мл сцинтиллятора) получается истинный раствор. Если объем водного препарата превышает 2,2 мл на 10 мл сцинтиллятора, то образуется очень мелкая эмульсия воды в органике (средний размер капелек — меньше ОД мкм). Поскольку свободный пробег (}-электронов трития в воде составляет около 0,5 мкм, эффективность счета в такой эмульсии оказывается еще достаточно высокой. В обоих случаях счет радиоактивности устойчив, но постепенно снижается с увеличением содержания воды. В истинном растворе это снижение обусловлено тем, что вода выступает в роли тушителя, а в эмульсии — увеличением среднего размера капелек.
В переходном интервале объемов (1,4—2,2 мл воды на 10 мл сцинтиллятора) лучше не работать: счет оказывается нестабильным, иногда наблюдается расслоение фаз. Есть также данные
о наличии резкого «провала» эффективности счета вблизи соотношения 0,2 мл воды на 10 мл сцинтиллятора [Pande, 1976]. В связи с этим не следует считать радиоактивность водных препаратов в толуол-тритоновых сцинтилляторах, если их объем не превышает 0,5 мл на 10 мл сцинтиллятора, — лучше разбавить препарат водой до 1 мл. Если же объем препарата больше 1,4 мл, то его следует разбавить до 2,2 мл, прежде чем вносить в 10 мл сцинтиллятора.
При счете физиологических жидкостей, растворов с высокой концентрацией солей и диссоциирующих агентов оптимальные пропорции толуола и тритона могут быть иными. Например, для счета 8 М раствора мочевины следует использовать соотношение
1 :1, а для 5%-ного раствора ТХУ — 13:7. Уже упоминалось, что присутствие сахарозы в препарате (>5%) заметно ухудшает эффективность счета, поэтому растворы сахарозы следует разбавлять водой. Если же из-за низкого уровня радиоактивности это сделать нельзя, то следует считать в растворе Брея. Щелочь в препарате следует нейтрализовать ввиду опасности возникновения хемолюминесценции.
Если в препарате ожидается высокое содержание тушителей, то вместо ППО и ПОПОП в качестве сцинтиллятора лучше использовать «butyl PBD» ^фирмы «NEN»), доводя его концентрацию до 10—12 г/л. Напомним, что молекулы тушителя конкурируют с молекулами сцинтиллятора за «захват» энергии возбуждения растворителя.
Коррекция тушения методом внешнего стандарта применима только в случае истинного раствора воды в сцинтилляторе, т. е. при соотношении 0,5—1,4 мл водного препарата на 10 мл сцинтиллятора. Для эмульсии этот метод применять нельзя! Методом отношения каналов {см. выше) можно пользоваться в обоих случаях, т. е. при любом соотношении объемов воды и сцинтиллятора.
Нередко тушение весьма существенно уменьшается при переходе от раствора к эмульсии (более 2,2 мл воды на 10 мл сцинтиллятора). Это, очевидно, имеет место в тех случаях, когда водорастворимые тушители остаются внутри капелек воды. Их собственная способность к поглощению энергии [1-частиц (без передачи через растворитель сцинтиллятора) ничтожно мала.
Растворимость белков и нуклеиновых кислот в толуольном сцинтилляторе обычно улучшается при добавлении небольшого количества какого-либо жирного производного четвертичного аммония. Довольно широкое распространение для этой цели получил, например, препарат с торговым названием («Hyamine hydroxide»). С ним и другими «солюбилизаторами» мы подробно познакомимся ниже, а сейчас лишь отметим, что все это — щелочи, которые при взаимодействии с биологическими молекулами могут стимулировать хемолюминесценцию.
Порядок внесения сцинтиллятора и препарата во флаконы счетчика имеет значение для обеспечения стабильного счета. Следует сначала заливать во флаконы толуольный сцинтиллятор, а потом (хотя это и менее удобно) вносить туда водный препарат и взбалтывать. По-видимому, смачивание стекла уменьшает полноту растворения или эмульгирования водного препарата в сцинтилляторе. Кстати, эмульсия препарата в толуол-тритоновом сцинтилляторе может быть не вполне прозрачной, но это вполне нормально.
Подводя итоги, следует отметить, что эффективность счета и особенно стабильность при хранении у толуол-тритоновых сцинтилляторов настолько выше, чем у диоксановых, что они почти вытеснили последние из практики современных лабораторий.
В качестве примера сдинтиллятора на основе я-ксилола приведем сравнительно недавно опубликованный рецепт смеси, названной «тритозол» [Fricke, 1975]: 600 мл п-ксилола, 257 мл Тритона Х-100, 106 мл этанола и 37 мл этиленгликоля. По данным автора, эффективность счета 3Н в тритозоле достигает 47%, а ,4С — 87%. Эти значения не очень высоки, но зато в данном сцинтилляторе можно просчитывать 10%-ный раствор сахарозы, 5 М мочевину, 1 М НС1 и 0,5 М NaOH. На 10 мл сцинтиллятора можно вносить до 3 мл водного препарата.
Приведем торговые названия и краткие характеристики широко распространенных сцинтилляционных смесей фирмы «NEN».
«Aquasob и «Aquasol-2» представляют собой сцинтилляторы на основе я-ксилола. Эффективность счета трития в них сохраняется на уровне 30% и 35% соответственно при добавлении к 10 мл сцинтиллятора 1 мл таких растворов, как 20%-ная сахароза, 8 М мочевина, 5%-пая ТХУ, 0,5 М НС1 и 0,5 М NaOH. При смешивании 10 мл водного препарата (!) с 10 мл сцинтиллятора «Aquasol-2» можно считать радиоактивность 3Н с эффективностью 20%.
