Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Флаконы изготавливают из обычного дешевого или боросиликатного (безкалиевого) стекла, из полиэтилена и нейлона. Последние два материала значительно дешевле, чем низкофоновое боросиликатное стекло, но проницаемы для растворителей: полиэтилен постепенно впитывает толуол, а нейлон — воду. Стеклянные флаконы склонны сорбировать липиды, белки, основные аминокислоты, некоторые катионы, поливалентные анионы и др. Сорбцию можно уменьшить силиконированием стекла или введением детергентов, например Тритона Х-100, в состав сцинтиллятора. Иногда для насыщения центров сорбции на поверхности втекла флаконы предварительно споласкивают раствором нера-
диоактивного, склонного сорбироваться вещества или вводят такого же рода «холодные» носители в состав препарата.
В результате сорбции на стекле радиоактивных веществ с высокой энергией р-излучения за счет самопоглощения может происходить сдвиг их спектра в сторону меньших энергий. Это может повлечь за собой перераспределение счета в каналах при регистрации двойной метки (см. ниже)—сорбированный 3Ф, например, может частично регистрироваться как “С.
Об увеличении, фона за счет радиоактивных примесей ‘°К в составе обычного стекла было сказано выше. Некоторые фирмы, наряду с обычными, предлагают более экономичные «мини-фла-коны» уменьшенного объема. Эффективность счета в них, особенно для трития, несколько хуже, а для установки их в прибор нужны специальные адаптеры. Мини-флаконы можно использовать для разделения счета згР и 14С. Для этого мини-флакон с препаратом, но без сцинтиллятора помещают внутрь нормального флакона со сцинтиллятором. Только p-излучение а2Р в этом случае проникает через стенку мини-флакона и просчитывается. После этого сцинтиллятор заливают и внутрь мини-флакона. Теперь прибор будет регистрировать суммарную радиоактивность 32Р и “С.
ЧЕРБНКОВСКОБ ИЗЛУЧЕНИЕ
Как известно, движение материальных объектов, в том числе элементарных частиц, со скоростью, большей скорости распространения света в пустоте (с=300ООО км/с), невозможно. Однако в прозрачной среде свет распространяется с меньшей скоростью, чем в пустоте. Эта скорость равна с/я, где п — коэффициент преломления света в среде (для воды пта 1,34). Ввиду этого возможна ситуация, при которой 0-частица, обладающая достаточной начальной энергией (>265 КэВ), будет пролетать через водную среду со скоростью, превышающей скорость света в этой среде, испуская бело-голубое свечение, предсказанное С. И. Вавиловым и впервые наблюдавшееся П. А. Черенковым. Оптический спектр этого свечения имеет монотонно снижающийся характер в интервале от 300 до 600 нм. В область спектральной чувствительности современных ФЭУ попадает около трети световой энергии черен-ковского излучения. Из сопоставления приведенного выше значения 265 КэВ с данными табл. 2 можно заключить, что из применяемых в биологии изотопов только 32Р и 1311 способны испускать Р-частицы таких больших энергий, что их прохождение через водную среду может сопровождаться черенковским излучением. Это излучение можно регистрировать с помощью обычного сцин-тилляционного счетчика. Надобность в сцинтилляторе при этом отпадает. Разбавленный водный раствор препарата, содержащего, например, радиоактивный фосфор, прямо заливают во флакон счетчика или просчитывают в пробирке, вставленной во флакон (иногда вместо этого употребляют специальные штативы для пробирок).
Одна ^-частица 3Ф, растрачивая на пути следования через растворитель свою энергию, успевает испустить в среднем 40 фотонов постепенно увеличивающейся длины волны, из которых 10—15 фотонов регистрируется фотоумножителями (если они распределяются между обоими ФЭУ —схема совпадений!). Слитный световой импульс, отмечающий испускание одной р-частицы, по своей интенсивности близок к средней интенсивности сцинтилляций при просчете радиоактивности трития. В соответствии с этим следует регулировать чувствительность счетчика излучения (устанавливать пороги усилителя).
Кроме чисто водной среды, черенковское излучение можно регистрировать и в других прозрачных жидкостях, например в растворах кислот. Тушение возможно и здесь, но только оптическое — за счет поглощения фотонов черепковского излучения на пути к ФЭУ окрашенными (особенно желто-красными) примеся-ми. Просчитываемые по черенковскому излучению растворы препаратов имеет смысл обесцветить, например перекисью водорода, не забывая при этом о возможности возникновения хемолюминесценции (прогревать!). Окрашенный препарат можно поме* стить в тонкостенную полиэтиленовую пробирку, а ее центрировать во флаконе с водой. В этом случае быстрые р-частицы, проходя через стенки пробирки в воду, обладают еще достаточной энергией для возбуждения черенковского излучения без тушения. В английской литературе такой прием получил название «Cherenkov insert». В случае необходимости поправку на оптическое тушение можно вводить по методу «отношения каналов», как описано ниже.
Необходимо подчеркнуть важность строго центрального рас-положения препарата при регистрации черенковского излучения, особенно если объем этого препарата мал. Как уже отмечалось, в процессе регистрации здесь участвует 10—15 фотонов. Черенковское излучение имеет направленный характер — под определенным углом к траектории полета р-частицы. При неудачном расположении препарата фотоны, испускаемые некоторыми р-частицами, будут попадать только в один из двух ФЭУ и соответствующие импульсы не смогут пройти через схему совпадений. Иногда полистироловую пробирку с препаратом центрируют в специально сконструированной крышке обычного флакона.
