Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Вообще говоря, скорость счета не должна влиять на его точность—играет роль только величина N. На практике это бывает не совсем так. При очень быстром счете электронные устройства могут не успевать регистрировать каждый импульс отдельно — «захлебываются». Два очень быстро следующих друг за другом импульса могут быть засчитаны за один. Реально такая опасность возникает при скорости счета, превышающей 100000 имnj /мин. Если приходится просчитывать радиоактивность на таком уровне, то следует вводить поправку, пользуясь соотношением:
ЛГ N
ист ’— ---------*
I - jVtC4/60
Здесь — истинная величина счета радиоактивности, N — величина, регистрируемая счетчиком (обе — в имп./мин), а тсч— постоянная времени для данного счетчика, известная из его описания. Обычно она лежит в пределах 10“5—10~® с.
Вводимая таким образом поправка может быть весьма заметной. Например, для тсч=10-5 с и #=600 000 имп./мин подсчет по приведенной формуле дает JV„CT—666 000 имп./мин. Если тсч неизвестно, то следует снизить уровень регистрируемой радиоактивности путем уменьшения количества подсчитываемого препарата. Для очень больших значений N, когда Nтм^60 приведенная формула теряет смысл, а счет невозможен.
Хемолюминесценций
Говоря о радиоактивных препаратах и сцинтилляторах, мы до сих пор не касались одного из серьезных источников ошибок в просчете радиоактивности — явления хемолюминесценции. Как явствует из самого названия, это свечение химического происхождения. Оно, как и всякое свечение, тоже связано с возбуждением электронов и последующим его высвечиванием, но энергию возбуждения в этом случае дает экзергоническая химическая реакция, которая протекает в препарате или сцинтилляторе. Фотоумножители регистрируют свечение хемолюминесценции и тем самым вносят ошибочную добавку к счету радиоактивности. Иногда эта «добавка» может измеряться тысячами импульсов в минуту и намного превышать счет истинной радиоактивности. Отсюда следует, что возможность возникновения хемолюминесценции никогда не следует упускать из виду. Нередко хемолюминесценцию удается обнаружить по характерному для нее затуханию свечения во времени. Сначала это затухание идет быстро — его легко заметить по снижению числа импульсов в минуту при повторном просчете препарата через несколько минут. Затем наступает фаза медленного затухания люминесценции —¦ в течение часов и даже дней. Здесь ее обнаружить труднее.
Присутствие в исходном препарате щелочи или «переваривание» биологического образца в щелочных «солюбилизаторах» (см. ниже) способствует возникновению хемолюминесценции. В случае использования в составе сцинтиллятора не очень хорошо очищенного толуола такая хемолюминесценция может быть продолжительной, поэтому перед внесением в жидкий сцинтиллятор препараты следует нейтрализовать уксусной, муравьиной или соляной кислотой (но не серной или хлорной!). Часто используемая для растворения гелей после электрофореза перекись водорода дает сильную хемолюминесценцию, которая, к счастью, исчезает при прогревании раствора в течение часа при 50° (при этом удаляются свободные радикалы). Во многих случаях таким образом удается подавить хемолюминесценцию и других перекисей.
Энергетический спектр длительной хемолюминесценции близок к трйтиевому. При счете 14С ее можно подавить регулировкой нижнего порога усиления. В приборах последних марок осуществляются автоматический учет и вычитание счета хемолюминесценции. Эту операцию выполняет встроенный в прибор ком-
/
пьютер после определенного анализа характера поступающих импульсов. Возможность идентификации импульсов хемолюминесценции базируется на своеобразии характера их совпадения при прохождении через схему совпадений. Хемолюминесценция, будучи результатом единичного акта химического взаимодействия, является в принципе однофотонным процессом, в отличие от пролета (1-частицы, когда возникает серия фотонов. Схема совпадений счетчика радиоактивности пропускает импульсы хемолюминесценции только за счет множества почти одновременно происходящих, но все же независимых актов испускания света. Эта особенность хемолюминесценции может быть обнаружена прибо* ром.
Фотолюминесценция
Это свечение возникает в препарате или сцинтилляторе в результате поглощения энергии ультрафиолетового облучения. В отличие от хемолюминесценции, оно может возникать повторно, при каждом новом облучении. Механизм фотолюминесценции сцинтилляциониых систем не изучен, поэтому ограничимся рекомендацией избегать облучения препаратов ярким солнечным светом и указанием на целесообразность выдерживания флаконов перед просчетом в темноте. Сцинтилляторы следует хранить в темных бутылях. Даже пустые флаконы после яркого освещения фосфоресцируют: стеклянные — за счет следовых количеств редкоземельных элементов, а пластиковые, особенно нейлоновые,— за счет пластификаторов.
Флаконы для жидкостных счетчиков
Выбор типа флаконов немаловажен. Надо учитывать уровень фона, возникающего за счет флаконов, прозрачность и другие физические характеристики их материала, в частности эффект воздействия на него ^-излучения от источника внешней стандартизации (см. ниже). Обычно флаконы изготавливают объемом в 20 мл и снабжают завинчивающимися пластиковыми крышками. В крышку, изнутри иногда бывает вмонтирован полиэтиленовый конус, улучшающий стекание жидкости обратно во флакон после его встряхивания.
