Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 118

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 112 113 114 115 116 117 < 118 > 119 120 121 122 123 124 .. 140 >> Следующая

Приведем пример из недавней работы. 25 мг тРНКВал растворяли в 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфера с 0,1 мМ ЭДТА, лиофилизировали и снова растворяли в 1 мл 3Н20 (1—5 Ки/мл). Ампулу с раствором запаивали и прогревали 30 мин при 90°. Тритиевую воду удаляли лиофилизацией, а быстро обменивающиеся водороды аминогрупп и гидроксилов освобождали от трития тремя перерастворениями в воде и лиофилизациями. В зависимости от УА тритиевой воды получали включение от 1,6 до 8 тыс. имп./мин на 1 мкг тРНК [Renaud et al., 1979].
Введение 3Н на З'-конец олигорнбонуклеохида (метод Рандерата)
В этом методе, получившем широкое распространение, используется двустадийная реакция. Сначала концевая рибоза на З'-ОН-конце олигонуклеотида раскрывается периодатным окис-
лением, а затем получающийся диальдегид восстанавливается до диольного производного с помощью 3Н-боргидрида натрия:
Особенно часто и плодотворно метод Рандерата используют при расшифровке первичной структуры РНК для обнаружения и идентификации пятен олигонуклеотидов после двумерного фракционирования гидролизатов методом ТСХ,
Например, три оптические единицы (>Ьбо) фрагментов тРНК растворяли в 100 мкл 7 мМ NaI04 и выдерживали при комнатной температуре, в темноте, в течение 4 ч. Затем добавляли 60 мкл 1 М К-фосфатного буфера (pH 6,8), 90 мкл свежеприготовленного ОД М раствора [3H]-KBHi в 0,1 М КОН и 290 мкл НгО, Инкубацию в темноте при комнатной температуре продолжали еще 4—5 ч. Избыток боргидрида разрушали добавлением 35 мкл 5 М СНзСООН. Препарат высушивали в токе воздуха, растворяли в 2 мл воды, очищали на колонке ДЭАЭ-целлюлозы (0,7X5 см), уравновешенной 0,05 М триэтиламмонийбгжарбонатиым буфером, pH 8,5 (элюция тем же буфером в концентрации 2 М), и обессоливали гель-фильтрацией. Включение составило 5 мкКи 3Н [Chen, Roe, 1978].
С учетом исходной УА боргидрида (0,7 Ки/ммоль) и полагая среднюю молекулярную массу фрагментов тРНК. равной 12 000, можно подсчитать, что такому включению отвечает введение метки в каждый из 3'-концевых нуклеозидов фрагментов тРНК. Интересно подсчитать также и количественные соотношения компонентов реакции в цитируемой работе. Три единицы А2в0 составляют около 120 мкг, т. е. порядка 0,01 мкмоль фрагментов (с 12 000). NaI04 было взято 0,7 мкмоль, т. е. с 70-кратным превышением, а [3Н]-КВН4 — 9 мкмоль, т. е. с 900-кратным превышением по отношению к молярному содержанию фрагментов тРНК. 175 мкмоль СН,СООН составляет 20-кратный избыток по отношению к КВН4. Большие величины избытков говорят о том, что точное следование прописи авторов отнюдь не обязательно.
С другой стороны, комбинация буфера pH 6,8 (конечная концентрация ~0,11 М) с КОН (конечная концентрация — 0,016 М) дает pH «7,5. Вести реакцию с участием боргидрида при таком pH невыгодно ввиду его распада, однако для тРНК это необходимо во избежание восстановления в щелочной среде дигидроуридина с разрывом его кольца (с гидролизатами обычных РНК реакцию можно вести при pH 9). Если вспомнить, что время полураспада боргидрида при pH 8 составляет 1 мин, то даже для 900-кратного его избытка инкубация в течение 4—5 ч не кажется оправданной.
в
Б
В
Приведенные расчеты иллюстрируют целесообразность критической оценки публикуемых экспериментальных процедур, если даже не с целью их усовершенствования, то хотя бы для оценки необходимости строго им следовать.
Недавно Рандерат предложил новый препарат для сверхчувствительного метода радиационного обнаружения окислен-ных перйодатом нуклеозидов и других карбонильных соединений (любых альдегидов и кетонов) — 3 ([3-1251]-иод-4-оксифе-нил)пропионилкарбогидразид. Он получается замещением остатка N-оксисукцкнимида в реактиве Болтона—Хантера на остаток карбогидразида. Концевая группа последнего легко связывается с диальдегидом окисленной рибозы или иным карбонилом. Препарат может быть получен с УА 2000 Ки/ммоль; он более стоек, чем боргидрид [Randerath, 1981].
Комплекс денатурированной ДНК с меченой N-метоксиаминокислотой
N-метоксипроизводное любой продажной радиоактивно меченной аминокислоты можно получить обработкой ее 2%-ным раствором формальдегида. Инкубация N-метоксиаминокислоты с денатурированной ДНК в течение 16—20 ч при комнатной температуре приводит к образованию комплекса между ними, достаточно устойчивого, чтобы выдержать промывку на мембранном фильтре 0,1 М NaCl и 5%-ной ТХУ [Sklobovksaja et al.,
1978].
Иодирование нуклеиновых кислот
Как и для белков, в качестве радиоактивного предшественника в этом случае используют Na 1251 без носителя. Иод присоединяется к кольцу пиримидинов в положение С5. Связь с цитозином заметно прочнее, чем с урацилом, поэтому для стабилизации удельной активности препарата имеет смысл после иодирования иод с урацила снять. Для этого достаточно умеренно прогреть препарат — 20 мин при 50—60°. Присоединение иода идет по тому же, что и ранее, механизму электрофильной атаки катиона 1251+. Для окисления аниона i25I- до катиона можно и здесь воспользоваться Хлорамином Т.
Предыдущая << 1 .. 112 113 114 115 116 117 < 118 > 119 120 121 122 123 124 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed