Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Очень широко используют радиоактивность при изучении бесклеточного синтеза белка in vitro. Этот исследовательский метод лишь с большой натяжкой можно отнести к числу способов получения радиоактивно меченных белков, поэтому ограничимся лишь его общей характеристикой и самыми необходимыми ссылками,
Система бесклеточного синтеза белка in vitro включает в себя полисомы, мРНК, полный комплекс транспортных РНК, необходимые соли, АТФ, ГТФ, систему регенерации АТФ (например, креатинфосфат н креатинфосфокиназу) и, наконец, аминокислоты — обычно 19 немеченных и одну радиоактивно меченную. Чаще всего в качестве таковой используют [35S]-метионин с УА^500 Ки/ммоль или [3Н]-лейцин с УА>190 Ки/ /ммоль. Разумеется, можно вводить метку и через другие меченые аминокислоты или их смесь. В продаже имеются готовые смеси всех радиоактивных (14С или 3Н) аминокислот в пропорциях суммарного белка хлореллы. Анализ меченых полипептидов осуществляют методами электрофореза или ИЭФ с последующей флюорографией.
Если полисомы ведут трансляцию эндогенных мРНК, вместе с которыми они были выделены, то синтезируются белки, характерные для клеток-доноров этой системы. Однако сами полисомы, как и тРНК, не отличаются высокой специфичностью и могут транслировать экзогенные мРНК, вносимые в инкубационную смесь отдельно от полисом. Эндогенные мРНК в этом случае предварительно разрушают умеренной обработкой фракции полисом микрококковой нуклеазой, так что рибосомальные РНК от этого не страдают. Трансляция экзогенных мРНК in vitro позволяет идентифицировать их специфичность*
Было отработано и получило признание несколько систем белкового синтеза in vitro с использованием разных источников
Полисом и тРНК, например из зародышей пшеницы, асцита Кребса и ооцитов лягушки. В последние годы ввиду высокой эффективности трансляции, дающей полноразмерные белки, и низкого уровня фонового синтеза (без экзогенной мРНК) широкое распространение получила система бесклеточного синтеза белка на основе лизата ретикулоцитов [Pelham, Jackson, 1976]. Фирма «iNEN» поставляет все компоненты этой системы, включая уже обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов, в виде готовых наборов («Translation Kit») с [35S]-метионином или [3Н]-лейцином. Недавно была описана еще одна, по утверждению ее авторов весьма совершенная система бесклеточного синтеза белка in vitro на основе культуры клеток яичников китайского хомячка [Fischer, Moldave, 1981].
Следует иметь в виду, что в продажных препаратах [35S]-метионина имеется некая неидентифицированная примесь, которая неэнзиматически связывается с любым белком. В случае низкого уровня белкового синтеза in vitro, идущего в присутствии большого количества постороннего белка (гомогенат), это может привести к заметной ошибке. Дитиотреитол и р-меркап-тоэтанол ослабляют описанный эффект. Примеси можно извлечь из препарата [35S]-метионина прединкубацией с балластным белком и последующей очисткой от него [Suissa, 1981].
Глава 4
ВВЕДЕНИЕ РАДИОАКТИВНОЙ МЕТКИ В НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Метилирование за счет меченого диметилсульфата
Диметилсульфат (СН»0)230г (ДМС) выпускается меченным как по углероду (УА до 50 мКи/ммоль), так и по тритию (УА до 5 Ки/ммоль). Он представляет собой жидкость, которая поставляется в заплавленных ампулах. Метка включается за счет метилирования остатков гуанина по N, и аденина по Ns. Реакция очень неприхотлива. Например, к раствору, содержащему 1 мг ДНК в 0,2 мл 0,05 М Na-фосфатного буфера, добавляли 1 мКи (25 мкмоль) [3Н]-ДМС и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем избыток ДМС удаляли диализом против того же буфера [Bearden, 1980].
Включение 3Н из тритиевой воды с помощью метабисульфита натрия
Под действием метабисульфита натрия (Na2S205) цитозин в составе нуклеиновой кислоты превращается в урацил. При этом из водной среды присоединяется протон. Внося в реакционную
смесь тритиевую воду, можно тем самым ввести в нуклеиновую кислоту тритиевую метку [Scheinker, 1976].
К достоинствам метода можно отнести дешевизну и высокую удельную активность исходного препарата (®Н20), а также легкость его последующего удаления гель-фильтрацией и упариванием. Кроме того, в реакцию гораздо «охотнее» вступают остатки цитозина, не участвующие в образовании водородных связей, следовательно, уровень включения для однонитевых ДНК на порядок выше, чем для двунитевых. Это открывает возможности исследования вторичной структуры нуклеиновых кислот. Недостаток метода — изменение химического состава нуклеиновой кислоты в результате замены некоторых остатков цитозина на урацил. Уровень такой замены и вытекающие из него последствия (например, для матричной функции ДНК) должны учитываться.
Медленный изотопный обмен водорода i
Еще в 2966 г. нами было обнаружено, что атомы водорода при С8 пуринов в тритиевой воде могут медленно замещаться на тритий без участия катализаторов. Скорость обмена очень сильно зависит от температуры: при 90° обменное равновесие достигается менее чем за час, а при 55° время полуобмена составляет 10 сут. Меченные таким образом препараты нуклеиновых кислот в виде замороженных водных растворов могут храниться неограниченно долго. При обычных для биологических реакций условиях (37°, несколько часов) обратным обменом трития в водной среде можно пренебрегать. Метод чрезвычайно прост и дешев — он сводится к растворению нуклеиновой кислоты в тритиевой воде и прогреву. Полнота обмена (уровень включения 3Н) и в этом случае зависит от вторичной структуры нуклеиновой кислоты. Используя 3Н20 с УА 1—3 Ки/мл, легко получить включение метки на уровне 107 имп./мин на 1 мг НК [Остерман и др., 1966].
