Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 102

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 140 >> Следующая

Немалую роль в улучшении выхода радиоактивности может сыграть обеспечение прозрачности самого фильтра. В частности, для этого важны полная смачиваемость материала фильтра толуолом и надежное высушивание фильтра. Лучшие результаты в этом плане дают стекловолокнистые фильтры типа GF/A-C. Для трития эффективный выход счета осадка на таком фильтре может достигать 10%, в то время как на бумажном фильтре удается просчитать лишь около 2% радиоактивности.
Положение фильтра во флаконе не играет существенной роли. Выигрыш счета от вертикальной ориентации фильтра невелик, а воспроизводимость ухудшается. Лучше укладывать все фильтры одинаково — на дно флакона, слоем осадка вверх. Объем сцинтиллятора при этом можно уменьшить до 2—5 мл.
Как ясно из изложенного, эффективный выход счета радиоактивности на фильтрах сильно зависит от характера осадка. Однако при некотором навыке можно добиться определенного постоянства этого характера и получить, например, линейную зависимость счета аликвот на фильтрах от времени инкубации системы белкового синтеза in vitro.
Таким образом, для относительных измерений радиоактивности метод счета на фильтрах пригоден и удобен. Этого нельзя сказать об определениях абсолютной радиоактивности препарата. Ни один из описанных ранее методов оценки эффективности счета здесь не пригоден, так как они не позволяют определить выход радиоактивности. Приближенно величину эффективного выхода счета на фильтрах можно оценить, смоделировав условия формирования и сбора осадка для точно известной радиоактивности аналогичного по своей природе препарата. Аналогия должна быть достаточно надежной. Например, нельзя определять эффективный выход счета белка на фильтре путем нанесения на него раствора радиоактивной аминокислоты. Это может привести к ошибке в несколько раз, причем в сторону как завышения, так и занижения выхода: хотя аминокислота и не образует плотного осадка, но зато проникает в глубь фильтра [Albright etal., 1978].
Естественно, что проблему неопределенности выхода радиоактивности можно снять путем растворения собранного на стекловолокнистом фильтре препарата с помощью рассмотренных выше солюбилизаторов. Так, фильтр типа GF с осадком белка или нуклеиновой кислоты можно обработать в течение 5 мин при 60° 0,5 мл Protosol, затем добавить 10 мл Econofluor и 50 млк уксусной кислоты (для подавления хемолюминесценции). Выход радиоактивности при этом увеличивается до 80—90%, и при эффективности счета 3Н около 47% можно получить эффективный выход счета для трития около 40%.
Еще более полный, 100%-ный выход радиоактивности получается при сочетании растворения осадка с растворением самого фильтра. Растворение мембранных фильтров можно осуществить с помощью ряда органических растворителей. Здесь надо проявлять осторожность, чтобы гарантировать растворение осадка, который при растворении фильтра (например, в диоксане) может в нерастворенном виде сесть на дно флакона со сцинтиллятором. В большинстве случаев лучше начать с гидролиза осадка еще на фильтре, например 1 М NH4OH при 60° в течение часа или (для ДНК) 0,5 М HCI в течение 20 мин на кипящей бане и т. д., а затем уже растворить и сам фильтр для полноты освобождения препарата. Для растворения осадков пригодны перечисленные выше фирменные солюбилизаторы. Между прочим, мембранные поликарбонатные фильтры (фирмы «Nucleopore») растворяются в солюбилизаторе Protosol при 55° за 10 мин. В этом случае осадок можно растворить одновременно с фильтром. Чисто нитро-целлюлозные фильтры (фирмы «Schleicher und Schfill») полностью растворяются в этилцеллозольве (моноэтиловом эфире этиленгликоля). Фильтры на основе смешанных эфиров целлюлозы (фирмы «Millipore») растворяются в метилцеллозольве и этилацетате.
При работе с сорбированными на мембранных фильтрах мо-номолекулярными слоями белков или нуклеиновых кислот филь-
тры можно растворять, не заботясь о предварительном гидролизе препаратов. Ввиду ничтожности их количества эти препараты перейдут в раствор, не образовав осадка.
Счет радиоактивности порошков
Тонкую суспензию порошка с сорбированным на нем радиоактивным препаратом можно с хорошей эффективностью считать в жидком сцинтилляторе, если помешать оседанию порошка на дно, что приводит к значительному самопоглощению. С этой целью в сцинтиллятор вносят добавки, которые, несмотря на их малое содержание, сообщают растворителю сцинтиллятора высокую вязкость, достаточную для предотвращения оседания порошка. Наиболее распространенным агентом такого рода является «СаЬ-o-Sil» — субмикроскопические частицы коллоидального кремнезема в виде цепей с большой удельной поверхностью (~200 м2/г). В концентрации 3—5% этот агент сообщает любому сцинтиллятору свойства почти прозрачного геля.
СЧЕТ РАДИОАКТИВНОСТИ ПОСЛЕ ТСХ И ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ
По окончании электрофореза радиоактивных препаратов из трубок геля вырезают диски диаметром 5—8 мм и толщиной 1—
2 мм, а из пластин — полоски или пятна для подсчета в них радиоактивности отдельных фракций. Нередко диски или полоски режут «вслепую» — равномерно по длине геля, но это нецелесообразно. Два пика одинаковой интенсивности и ширины могут в этом случае оказаться представленными совершенно по-разному. Один из них может попасть в диск целиком, и вся его радиоактивность будет просчитана в этом диске. Другой пик может оказаться разрезанным на две равные части, так что будет одинаково просчитан в двух дисках; это создаст представление о вдвое более широкой фракции с вдвое меньшей, чем в первом случае, концентрацией радиоактивного вещества. Целесообразно сначала обнаружить полосы и пятна с помощью окраски или авторадиографии {см. ниже), а затем для счета вырезать из геля только сами полосы и пятна.
Предыдущая << 1 .. 96 97 98 99 100 101 < 102 > 103 104 105 106 107 108 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed