Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Иногда требуется просчитать целые микроорганизмы, например для контроля за включением в них радиоактивности. Их можно также собирать фильтрованием, фиксировать обработкой ТХУ и отмывать от предшественников, как описано для осадков биополимеров.
Качественно за включением 38Р можно наблюдать еще проще.
2 мкл суспензии бактерий наносят на нитроцеллюлозный мембранный фильтр, и бактерии сорбируются. Радиоактивную среду удаляют промывкой фильтра 0,15 М NaCl. Затем регистрируют черенковское излучение, погрузив фильтр в 10 мл воды.
Обработку монослоев белков, рибосом или нуклеиновых кислот, сорбированных на мембранных фильтрах, производят в основном так же, как и осадков (ТХУ->-спирт-»-эфир). Подробнее такая обработка будет описана при рассмотрении методов гибридизации биополимеров на мембранных фильтрах.
Полоски и пятна, вырезанные из бумаги после хроматографии или электрофореза, нарезают кусочками и высыпают во флакон со сцинтиллятором. Так же можно поступать после тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с пластиковыми подложками. После ТСХ на стеклянных пластинках целлюлозу или силикагель из пятна выскребают и в сухом виде погружают в сцинтиллятор. При этом почти неизбежны потери порошка. Их можно избежать, воспользовавшись следующим изящным приемом. Растворяют несколько нитроцеллюлозных фильтров до весовой концентрации 1—2% в смеси этанол—эфир или этанол—ацетон (1:1). Контур пятна на пластинке процарапывают иглой, а затем на него наносят 1—5 капель (в зависимости от размера пятна) раствора нитроцеллюлозы. При высыхании растворителя образуется «лепешка» из нитроцеллюлозы, которая отслаивается от стекла. Ее пинцетом переносят во флакон со сцинтиллятором. Эффективность счета —такая же, как на бумажном фильтре [Ttxchinsky, Shershneva, 1973].
Во всех случаях работы с фильтрами (и порошками) надо убедиться в том, что радиоактивность не переходит с фильтра в сцинтиллятор. В противном случае счет будет невоспроизводимым, а при повторном использовании сцинтиллятора (как это обычно практикуется при счете на фильтрах) и просто неверным.
Убедиться в этом несложно, просчитав сцинтиллятор после удаления из него фильтра. Если радиоактивность с фильтра вымывается в сцинтиллятор, то лучше перейти на полную предварительную элюцию радиоактивного препарата с бумаги или порошка, например в 0,5 н. НС1, и считать его в растворенном виде.
С ионообменных фильтров («Wbatmann DE-81»), где ионная фиксация молекул идет во всей толще фильтра, нуклеотиды или короткие олигонуклеотиды лучше элюировать 0,5 М раствором NaCl в 1 М НС1. Полимерные нуклеиновые кислоты с этих фильтров элюировать трудно.
Эффективность счета. Выход радиоактивности
При счете радиоактивности на фильтре эффектавность счета снижается по сравнению со счетом в растворе по целому ряду причин. Если препарат в виде осадка лежит на поверхности фильтра или частично внутри него, то нельзя избежать самопо-глощения части энергии jj-частиц в самом материале осадка. Энергия р-частиц будет растрачиваться и на соударения с пространственной сеткой фильтра. Кроме того, возможны случаи, когда фотоны, образовавшиеся в сцинтилляторе внутри фильтра, не смогут в достаточном для регистрации количестве достигнуть обоих ФЭУ. Таким образом, оказывается, что часть ^-частиц или вовсе не дает вспышек — не выходит в сцинтиллятор, или как бы не дает их (если ФЭУ их «не видят»). Это явление количественно описывается понятием «выход радиоактивности». Имеется в виду доля полной радиоактивности, заведомо достигнувшая свободного объема сцинтиллятора. Будет она просчитана полностью или нет — определяется уже эффективностью счета (данного изотопа в данном сцинтилляторе при данной регулировке прибора).
Таким образом, выход радиоактивности и эффективность счета— это понятия разные. Оба они характеризуют потери счета радиоактивности, но происходят эти потери по совершенно разным причинам. В случае растворения препарата в сцинтилляторе выход радиоактивности заведомо равен 100%, а эффективность счета может оказаться и невысокой. При счете на фильтре эффективность может быть и хорошей (например, 90% Для 14С), а выход нередко лежит в пределах 10—40%- Произведение этих двух величин, учитывающее все потери, можно назвать «эффективным выходом счета радиоактивности».
На выход радиоактивности при счете на фильтре весьма влияет плотность и расположение осадка. Следует добиваться равномерного распределения осадка, по возможности не очень обильного, по всей площади фильтра. Обильность необходимого для
счета осадка зависит, конечно, от удельной радиоактивности материала. Когда она очень мала, осадок приходится увеличивать. Но не следует гнаться за высоким уровнем счета ценой увеличения плотности осадка — надежнее подольше просчитать препарат. Следует проявлять осторожность и в использовании холодных носителей для соосаждения. Самопоглощение на стекловолокнистых фильтрах существенно проявляется, начиная примерно с плотности осадка в 1 мг/см!.
Снижение выхода радиоактивности за счет самопоглощения в осадке страшно не само по себе, а своей невоспроизводи-мостью. Все зависит от структуры осадка, от степени его смачиваемости сцинтиллятором. Структура же осадка определяется ходом трудно контролируемого процесса осаждения. Желательно получить рыхлый, равномерный слой осадка, без комков. Для этого надо поварьировать способ осаждения. Например, при осаждении белка из инкубационной смеси 5%-ным раствором ТХУ добавление соответствующего малого количества концентрированной кислоты может привести к образованию плотного комка, в то время как консистенция осадка при добавлении равного объема 10%-ного раствора ТХУ может оказаться вполне приемлемой. Нередко, когда нужно осадить радиоактивный материал из объема 0,1—0,2 мл, его имеет смысл сначала разбавить примерно десятикратным количеством холодной воды, а затем уже добавлять ТХУ, цетавлон или другие осаждающие агенты. Наиболее воспроизводимые результаты получаются в тех случаях, когда осадок образуется по всему объему рыхлыми хлопьями, напоминающими хлопья снега. Есть данные, что равномерность распределения слоя белкового осадка на бумажном фильтре улучшается при добавлении в препарат до 0,05—0,1 М NaOH [Durham, Lopez-Solis, 1979].
