Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для осадков белков и нуклеиновых кислот можно рекомендовать следующую очередность промывок: три раза холодной 5%-ной ТХУ, два раза этанолом, один раз смесью этанол—эфир (3:1) и один раз эфиром. Последние две промывки предназначены для удаления следов воды. Она препятствует смачиванию фильтра толуольным сцинтиллятором, в котором фильтры просчитывают после предварительного высушивания их на воздухе в течение 10—15 мин при комнатной температуре (до исчезновения запаха эфира).
Несмотря на тщательную промывку, нередко можно обнаружить значительный фон радиоактивности за счет неспецифической сорбции молекул предшественника на материале фильтра
----- или на самом осадке биополимера. Для его
уменьшения имеет смысл добавить в ТХУ «холодный» предшественник в 100-кратном избытке по отношению к радиоактивному. При исследовании белкового синтеза им может служить идентичная радиоактивной аминокислота, при изучении синтеза нуклеиновой кислоты — соответствующий нерадиоактивный нуклеозидтрифосфат или, что дешевле, просто пирофосфат, поскольку сорбция трифосфатов идет, как правило, по остаткам фосфорной кислоты. Кстати, пирофосфат— мощный ингибитор синтеза нук-
Рис. 71. Прибор дли фильтрования с разрежением
/ — верхний резервуар со шлифованным фланцем; 2 — стеклянный пористый фильтр со шлифованным фланцем (рабочий фильтр кладут на стеклянный, фланцы сжн»ают пружинными зажимами); 3 — колба Бунзена
леиновых кислот, поэтому его нередко используют для мгновенной остановки такого синтеза, добавляя прямо в инкубационную смесь.
В случае малых объемов инкубационной смеси или для просчета малых аликвот не обязательно проводить предварительное осаждение и собирать осадок путем фильтрования. До 50 мкл реакционной смеси или раствора биополимера после фракционирования переносят на кружок из толстой фильтровальной бумаги, дают жидкости впитаться и фильтр слегка подсушивают. Эту операцию можно провести для нескольких десятков пронумерованных фильтров, ряд за рядом наколотых булавками на слой резины, так что они его не касаются. Затем вместе с булавками фильтры помещают в стакан с 5%-ным раствором ТХУ, где осаждение полимера идет уже внутри фильтра. Одновременно начинается отмывка предшественников. С булавок фильтры снимать не следует, так как это предохраняет их от слипания.
Иногда даже саму реакцию, например синтез белка или ами-ноацилирование тРНК, ведут прямо на фильтрах. Наносят на серию наколотых, как описано, фильтров все компоненты инкубационной смеси и помещают резину с фильтрами во влажную камеру, термостатированную при температуре реакции. По окончании фильтры слегка подсушивают и помещают в раствор ТХУ.
Можно использовать и хроматографический метод отмывки предшественников, В 5—6 см от края листка «Whatman ЗММ» карандашом рисуют ряд пронумерованных квадратиков размером 2x2 см, наносят на них по 25 мкл препарата, подсушивают и край бумаги опускают в «лодочку» хроматографической камеры, заполненной 5%-ным раствором ТХУ. Когда фронт кислоты уйдет на расстояние 10 см за линию квадратиков, все кислоторастворимые радиоактивные предшественники будут из них отмыты. Полоску можно вырезать, обработать этанолом и эфиром, как указано выше, подсушить, а затем разрезать на отдельные квадратики для просчета.
Для фракций, полученных с хроматографической колонки или после градиентного центрифугирования, проблемы отмывки предшественников не существует. Препараты на фильтрах достаточно осадить однократной обработкой ТХУ, а затем только удалить воду с помощью этанола и эфира.
Подчеркнем еще раз важность полного удаления воды. В противном случае внутренний, сохранивший остатки воды объем фильтра окажется недоступным для сцинтиллятора, а находящаяся в нем часть радиоактивности останется непросчитанной. Хорошо высушенный бумажный фильтр в толуольном сцинтилляторе выглядит полупрозрачным и однородным. Если в нем заметны неоднородности или блестящие пузырьки, значит, вода удалена не полностью, так что следует повторить обработку спиртом с эфиром.
В одном осадке на фильтре можно дифференцировать включение одного и того же изотопа (например, “С из общего пред-
шественника — бикарбоната) в РНК, ДНК и белки. Для этого надо воспользоваться известными приемами избирательного растворения и вымывания из осадка одного из этих биополимеров за другим. Сначала, путем обработки 0,5 М NaOH при 37° в течение 40 мин, частично гидролизуют РНК — она становится кислоторастворимой и вымывается 5%-ным раствором ТХУ. Далее обработка тем же раствором ТХУ, но при 80° в течение 30 мин делает кислоторастворимой ДНК, и ее тоже можно вымыть из осадка холодной ТХУ. Остающаяся радиоактивность принадлежит белкам. После каждого промежуточного просчета радиоактивности толуольный сцинтиллятор отмывают эфиром или же проводят три различные обработки трех «параллельных» фильтров с одинаковыми количествами исходного препарата. Результаты получаются не слишком точными, как всегда, когда они зависят от полноты растворения. В частности, при растворении ДНК температуру не следует поднимать выше 80° из-за опасности частичного растворения белка.
