Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
4 раза против обычного для цилиндрических гелей значения и удлинения времени электрофореза до 2 сут.
С помощью такой же системы успешно фракционировали 10 мг суммарного препарата нуклеиновых кислот дрожжей [Bos-tian et al., 1979]. Разделение нельзя было назвать хорошим (4S и 5S РНК практически не разделялись). Кроме того, при непре-рывнЪй элюции получались сильно разбавленные препараты, из которых нуклеиновые кислоты приходилось осаждать с добавлением носителя.
По-видимому, для препаративного электрофореза нуклеиновых кислот следует предпочесть другую систему [Polsky et al., 1978]. В этом случае разделение 35 мг рестриктазных фрагментов ДНК проводили в горизонтальной пластине агарозы сечением 45 см2. Для внесения препарата в гель и его элюции служили прямоугольные камеры, прилегающие к торцам пластины (рис. 43). Камера элюции объемом 12 мл была отделена от сле-
1 — командное устройство; 2 — источник напряжения; 3 — датчик уровня буфера -в камере элюции; 4 — камера элюции; 5 — камера для препарата; 6 — элюирующий буфер; 7 и 10 — насосы; 8 — диализная мембрана; 9 — коллектор фракций; 11 — пластина агарозы
дующего за ней анодного резервуара диализной мембраной. Электрофорез на расстоянии 8 см вели при напряженности поля
10 В/см. Камеру элюции автоматически опорожняли в коллектор фракций через каждые 30 мин и снова заполняли свежим буфером. Электрическое напряжение на это время отключали. Интервал времени между опорожнениями камеры можно было регулировать. Благодаря такой прерывистой элюции значительного разбавления препаратов не происходило. ДН-К, свободную от примесей агарозы, получали с выходом около 90%. Ее можно непосредственно подвергать дальнейшей рестрикции, сшиванию лигазой и т. д. Недавно описан упрощенный вариант этой же системы [Wertz et al., 1980].
Значительно быстрее, хотя и с заметно меньшим выходом (50—75%), препаративное разделение ДНК в толстой пластине агарозы (35X13X3 см) производили Праудфут и Баралль [Proudfoot, Baralle, 1979]. В канавку, вырезанную в пластине 0,8%-ного геля агарозы, вносили 5 мг рестриктов ДНК в смеси с 0,5%-ным раствором агарозы. Электрофорез вели при малой плотности тока (0,5 мА/см2). Полосы ДНК обнаруживали с помощью бромистого этидия. Затем перед каждой полосой, со стороны анода, в геле вырезали канавку шириной 1 см. В нее укладывали диализную пленку так, чтобы закрыть анодную сторону канавки, и заполняли ее буфером. Возобновляли электрофорез и вели его до тех пор, пока полосы ДНК полностью не выходили в канавки (наблюдение при ультрафиолетовом освещении).
В 70-е годы был описан целый ряд других устройств для препаративного фракционирования нуклеиновых кислот электрофорезом при вертикальном расположении геля, однако по производительности, простоте и надежности они явно уступают рассмотренным выше примерам.
d*Abbis A., Pantaloni С., Bechet Л— Europ. J. Biochem., 1979, 99, p. 261—272.
Allis C. D.t Glover С. V. С., Gorov-sky M. A.— Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1979, 76, p. 4857—4861.
Aloyo V. /.— Anal. Biochem., 1979,
99, p. 161—164.
Alwine J. C.t Kemp D. /., Stark
G. /?.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1977, 74, p. 5360—5354.
Amaldi P.— Anal. Biochem., 1972, 50, p. 439—441.
Anderson L. E., McClure W. 0.— Anal Biochem., 1973, 51, p. 173— 179.
Andersson P., Goldfarb M. P., Weinberg R. A—Cell, 1979, 16, p. 63—
70.
Auger L. Т., Saunders G• F.— Anal. Biochem., 1977, 79, p. 338—348.
Bachrach H. L.— Anal. Biochem., 1981, 110, p. 349—354.
Bailey Л MDavidson N.— Anal. Biochem., 1976, 70, p. 75—85.
Bukayev V. V.t Bakayeva T. G.t Schmatchenko V. V., Georg iev
G. P.— Europ. J. Biochem., 1978, 91, p. 291—301.
Barger В. O., White F. C.f Pace J. L., Kemper D. L.t Ragland W. L— Anal. Biochem., 1976, 70, p. 327—
335.
Barnes W. M.— Science, 1977, 195, p. 393—394.
Baumann G., Chrambach A — Anal. Biochem., 1976, 70, p. 32—38.
Bean W. I., Sriram Jr. G.t Webster R. G — Anal. Biochem., 1980, 102, p. 228—232.
Bernabeu C„ Martinez ОVazquez D., Ballesta /. P. G.—Anal. Biochem.,
1979, 92, p. 203—204.
Bernabeu СSanchez-Madrid F.f Amils R.— Europ. J. Biochem., 1980, 109, p. 285—290.
Bertolini M. Tankersley D. L., Schroeder D. D.— Anal. Biochem., 197-6, 71, p. 6—13.
Bhakdi S., Bhakdi-Lehnen В., Bjer-rum O. J.— Biochim. et biophys. acta, 1977, 470, p. 35—44.
Bhatnagar Y. М., Bellve A. R.— Anal. Biochem., 1978, 86, p. 754—760.
Bittner М., Kupferer P., Morris C. F.— Anal. Biochem., 1980, 102, p. 459— 471.
Blakesley R. W., Boezi J. A.— Anal. Biochem., 1977., 82, p. 580—582. ,
Blankstein L. A., Stollar B. D., Franklin S. G., Zweider A.> Levy S. B.— Biochemistry, 1977, 16, p. 4557— 4562.
\Bloom К 5., Anderson J. N.— Anal. Biochem., 1979, 98, p. 410—416.
Bode H. Л—Anal. Biochem., 1977, 83, p. 204—210.
Bonner W. М., Laskey R. A.— Europ. J. Biochem-, 1974, 46, p. 83—88.
Bonner W. М., West М. H. P., Sted-man J. D.— Europ. J. Biochem., 1980, 109, p. 17—23.
