Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 75

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 130 >> Следующая

Одновременно аналогичное устройство для электрофоретического переноса ДНК, РНК и белков из геля агарозы на ДБМ-бу-магу было описано в другой работе [Stellwag, Dahlberg, 1980]. Авторы отмечают, что неденатурированная ДНК с ДБМ-бумагой связывается плохо — более 90% ее уходит при промывке бумаги. Впрочем, двунитевые рестрикты ДНК фага PMF2 связываются с эффективностью 77%. Возможно, что это происходит за счет, однонитевых участков ДНК в местах рестрикции. За счет нековалентного связывания ДНК и РНК (а также полисом) ДБМ-бу-мага, независимо от активности своих диазониевых групп (см. ниже), сорбирует 25—30 мкг нуклеиновой кислоты на 1 см2. Нековалентно связанный материал можно снять промывкой солевым раствором, содержащим 0,1% ДДС-Na, в течение ночи.
Важно отметить наблюдение авторов, касающееся быстрой инактивации ДБМ-бумаги при ее хранении во влажном состоянии (25 мМ Na-фосфэтный буфер, pH 5,5, при 4°) после диазотирования. За 12 ч связывающая способность бумаги падает до 20% от первоначального уровня, а за сутки утрачивается полностью. Инактивация идет ускоренно в слабощелочной среде. При pH 8—9 полная потеря активности бумаги наступает через
2 ч.
Недавно Томас показала, что короткие фрагменты ДНК (100—200 нуклеотидов), а также РНК можно прочно «посадить» на нитроцеллюлозные фильтры переносом из геля агарозы по методу Созерна, если перед электрофорезом их денатурировать в 1 М растворе глиоксаля в 50%-ном водном диметилсульфокси-де. Электрофорез следует вести при нейтральном значении pH, чтобы сохранить присоединение глиоксаля по остаткам гуанина.
Глиоксаль препятствует частичной ренатурации нуклеиновой
кислоты во время переноса из геля, что необходимо для связывания ее с фильтром. В ходе последующей фиксации нуклеиновой кислоты на фильтре глиоксаль снимается, поэтому можно осуществить ее тестирование путем гибридизации с меченой комплементарной молекулой [Thomas, 1980].
Нативную ДНК можно переносить из агарозы на ДЭАЭ-бу-магу вымыванием током слабого солевого раствора, как и в случае метода Созерна. При манипуляции с листами ДЭАЭ-бумаги ввиду ее хрупкости следует применять определенные приемы [Winberg, Hammarskjold, 1980]. В частности, предварительную обработку бумаги кислотой и щелочью следует вести в пачках по 20—40 листов, а для дальнейших переносов на отдельные листы накладывать полиэтиленовую пленку. Нативная ДНК с М^б млн. переходит на ДЭАЭ-бумагу за 24 ч; для элюции ДНК с М<2 млн. достаточно 6 ч. Полосы ДНК на бумаге обнаруживают, наливая на ее поверхность раствор бромистого этидия в исходном буфере. Вырезанные затем полоски элюируют 1 MNaCl при центрифугировании в микропробирках с проколотым кончиком. Авторадиографию осуществляют, как обычно,— наложением рентгеновской пленки. Емкость бумаги «Whatman DE-81» составляет до 15 мкг ДНК на 1 см2 бумаги.
В препаративном варианте нативную ДНК можно элюировать электрофоретически в микрогранулированную ДЭАЭ-целлюлозу, которой заполняют канавку, вырезанную рядом с полосой ДНК в геле. Для элюции ДНК с помощью 1 М NaCl ДЭАЭ-целлюлозу переносят в микроколонку.
В заключение отметим еще один частный случай избирательной сорбции РНК, вымываемой из геля. Речь идет об элюции мРНК после электрофореза в 2%-ном геле агарозы прямо из измельченного геля на микроколонку олиго(дТ) -целлюлозы. Агарозу на колонке обильно (500 мл на 0,2 г геля) промывают 0,5 М КС1 в 0,01 М Трис-HCl (pH 7,4). РНК постепенно вымывается из геля, и содержащаяся в ее составе мРНК сорбируется на олиго(дТ) -целлюлозе. Затем агарозу удаляют из колонки, а мРНК элюируют буфером без соли [Auger, Saunders, 1977].
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ
Для оценки радиоактивности нуклеиновых кислот после электрофореза используют те же приемы, что были описаны в главе 3 Для белков (счет радиоактивности жидких элюатов, растворение геля, авторадиография и непрямая авторадиография с интенсифицирующими экранами и, наконец, флюорография). В подавляющем большинстве случаев нуклеиновые кислоты метят радиоактивным фосфором. Ввиду высокой энергии его ^-излучения для регистрации положения полос в геле пользуются авторадиографией или непрямой авторадиографией.
Для количественного счета радиоактйвности после электрофореза в геле агарозы последний можно просто расплавить. К полоске агарозы, содержащей нуклеиновую кислоту, добавляют 0,5 мл 1 н. НС1 и нагревают до 90е НС1 частично гидролизует нуклеиновую кислоту, что улучшает ее растворимость в сцинтилляторе; кроме того, НС1 предотвращает хемолюминесценцию. Расплавленную агарозу охлаждают до 60°, добавляют 10 мл «Biofluor», «Aquasol-2», или другого толуол-тритонового сцинтиллятора и хорошо перемешивают. Выход радиоактивности составляет почти 100%.
ПРЕПАРАТИВНЫИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Для препаративного электрофореза ДНК и РНК в гелях агарозы Хаген использовал трубки диаметром 5,9 или 7,7 см, просто обрезав для этой цели мерные цилиндры на 1 или 2 л. Расплавленную в соответствующем буфере агарозу он заливал на высоту 12—15 см. Камера элюции на нижнем конце цилиндра была образована двумя сетками и диализной мембраной. Элюцию вели непрерывно со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве элюента использовали нижний электродный буфер, в который для охлаждения цилиндр погружали на всю высоту геля. Буфер поступал в камеру элюции по ее периферии и отсасывался через трубку, выведенную из центра нижней сетки камеры [Hagen, 1979]. Агароза не прилипает к стеклу цилиндра, поэтому во избежание миграции нуклеиновых кислот по зазору вдоль стенок препарат вносили в углубление меньшего диаметра, чем цилиндр, сформированное на верхнем торце геля агарозы при ее застывании. Заметного перетекания буфера по зазору не происходило, так как гель находился под гидростатическим давлением столба жидкости высотой 10 см (верхний электродный буфер). Проблему нагревания геля решали путем снижения плотности тока в 3—
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed