Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 74

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 130 >> Следующая

6 Л. А. ОстермвВ
ИИ
Перенос нуклеиновых кислот из геля; на нитроцеллюлозные фильтры и диазобумагу
Упомянутый выше перенос ДНК из агарозы на нитроцеллюлозу, предложенный в 1975 г. Созерном, основан на избирательной способности мембранных нитроцеллюлозных фильтров (например, «Millipore НА») сорбировать на своей поверхности денатурированную ДНК [Southern, 1975]. В оригинальном методе Созерна денатурированную ДНК из геля просто вымывают крепким солевым раствором. Ток жидкости от геля к нитроцеллюлозе обеспечивается капиллярными силами. Как показано на рис. 42, на стекло кладут лист фильтровальной бумаги («Whatman ЗММ»), смоченной солевым раствором (3 М NaCl+0,3 М Na-цит-рат). На него кладут полоску геля между двумя полосками плексигласа такой же толщины, что и гель. На полоску геля накладывают нитроцеллюлозный фильтр, смоченный разбавленным солевым раствором (0,3 М NaCl+0,03 М Ыа-цитрат). Его края заходят на полоски из плексигласа. Затем кладут две полоски бумаги «Whatman ЗММ», смоченные тем же раствором, причем так, что они примерно на 5 мм перекрывают фильтр с двух его противоположных сторон. Наконец, все это сверху накрывают несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Этот «сэндвич» выдерживают в течение нескольких часов, иногда добавляя концентрированный раствор солей к нижнему листу бумаги «Whatman ЗММ» (в зазоре между полоской геля и полосками плексигласа жидкости быть не должно).
Значительная доля ДНК вымывается из геля током жидкости, идущим от нижнего листа фильтровальной бумаги через гель и нитроцеллюлозный фильтр к верхним, первоначально сухим, слоям бумаги. На нитроцеллюлозе эта ДНК прочно сорбируется в тех местах, которые лежат непосредственно над полосами ДНК в геле. Высокая концентрация соли способствует сорбции. После этого с помощью известных методов гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах (их рассмотрение выходит за рамки этой книги) можно идентифицировать отдельные полосы ДНК в этой «копии», а следовательно, и в самом геле.
В описанном методе, несмотря на его очень широкое применение в генной инженерии, есть свои слабые стороны. Так, крупные рестрикты ДНК плохо переносятся из геля на нитроцеллюлозу, а малые фрагменты (200—300 оснований) плохо на ней сорбируются.
В этом плане в качестве «сорбента» для ДНК следует предпочесть уже упоминавшееся диазотированное бензилоксиметиль-ное производное целлюлозы, получающееся путем определенной обработки фильтровальной бумаги («Whatman 540»). Эта так •называемая «диазобумага», или «ДБМ-бумага», была разработана Олвином и соавторами [Alwine et al., 1977]. В главе 3 указывалось на возможность ее использования для получения афин-ных сорбентов, применяющихся для задержания определенных
Рис. 42. Система переноса ДНК из геля агарозы на нитроцеллюлозный фильтр путем ее вымывания [Southern, 1975]
/—нитроцеллюлозный фильтр; 2—полоска геля агарозы; 3 и 4 — влажная фильтровальная бумага; 5 — пластуны плексигласа; 6 — сухая фильтровальная бумага
белков, вымываемых из геля после электрофореза. Для этого на ДБМ-бумагу надо было сначала «посадить» антитела или другие связывающие белок «лиганды». Здесь дело обстоит проще: нуклеиновые кислоты любого размера связываются с самой ДБМ-бумагой ковалентными связями по ее диазониевым группам. Вместе с тем сохраняется их способность гибридизоваться с комплементарными молекулами.
Система переноса нуклеиновых кислот из геля на ДБМ-бумагу, описанная Олвином и соавторами, отличается от системы Созерна только тем, что здесь отпадает необходимость использовать крепкий солевой раствор. Нуклеиновые кислоты из геля можно вымывать слабым боратным или фосфатным буфером.
Ввиду того, что ДБМ-бумага надежно связывает и мелкие фрагменты нуклеиновых кислот, эффективность переноса ДНК из геля на бумагу можно значительно повысить путем дробления ДНК непосредственно в полосах, полученных в результате электрофореза. Для этой цели было предложено гель агарозы после электрофореза вымачивать в 0,25 М НС1, что влечет за собой частичную апуринизацию ДНК, а затем обрабатывать солью и щелочью (1 М NaCl + 0,5 М NaOH), что вызывает разрыв нити ДНК по местам апуринизации. Полученные таким образом фрагменты ДНК легко переходят на ДБМ-бумагу, сохраняя свою способность к гибридизации [Wahl et al., 1979].
Система переноса, использованная в этой работе, еще проще. Нейтрализованный вымачиванием в буфере гель кладут на два листа бумаги «Whatman ЗММ», смоченной 1 М раствором Na-ацетата (pH 4). Влажную бумагу вокруг пластины геля просто прикрывают пленкой, на гель кладут ДБМ-бумагу, а на нее — два листа сухой «Whatman 3 ММ» и толстый слой сухих бумажных салфеток. Для равномерности контактов все это прижимают небольшим грузом через стеклянную пластинку. Перенос ДНК занимает 2—3 ч. Такой перенос можно осуществлять одновременно в обе стороны от пластины геля — на два листка
ДБМ-бумаги с целью получения двух одинаковых реплик [Smith, Summers, 1980].
Естественно, что перенос можно ускорить наложением электрического поля в поперечном направлении — от геля к нитроцеллюлозе или ДБМ-бумаге, т. е. заменить вымывание ДНК из геля ее электрофоретической элюцией. Недавно было описано очень простое устройство для этой цели в виде разъемной рамки из плексигласа с диализной пленкой и электродами из платиновой проволоки {Bittner et al., 1980]. Гель агарозы кладут на пропитанный буфером нитроцеллюлозный фильтр или ДБМ-бумагу, с обеих сторон к ним прикладывают пропитанные буфером листки фильтровальной бумаги и все это зажимают между двумя половинками рамки. Ее помещают в ванночку с тем же буфером и включают напряжение «поперечного электрофореза». Напряженность электрического поля приходится регулировать в зависимости от величины фрагментов ДНК, чтобы мелкие фрагменты не «проскакивали» через нитроцеллюлозу или ДБМ-бумагу до того, как они успеют закрепиться на них. Очень крупные молекулы ДНК авторы рекомендуют фрагментировать после электрофореза, обрабатывая их малой концентрацией ДНКазы прямо в геле.
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed