Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Назначение диализного мешочка или мембраны состоит в том, чтобы помешать вышедшей из геля нуклеиновой кислоте мигрировать дальше к аноду. Этого можно добиться и другим путем: поместить на пути миграции сорбент, прочно связывающий нуклеиновую кислоту, причем сделать это так, чтобы по окончании элюции и сорбции нуклеиновой кислоты можно было бы легко извлечь сорбент из геля и уже из него простыми средствами элюировать нужный препарат. Этот вариант имеет еще и то преимущество, что сорбент может избирательно сорбировать только нуклеиновую кислоту и тем самым осуществлять ее очистку от следов агарозы и других примесей, выходящих из геля.
В качестве сорбента можно, например, использовать ДЭАЭ-бумагу «Whatman DE-81». Диск из такой бумаги вымачивают в электродном буфере и прижимают к анодному концу трубки с гелем с помощью полиэтиленовой трубки с закраинами [Malhorta et al., 1978]. В цитируемой работе таким образом препаративно разделяли 4S и 5S РНК, слабо окрашенные (для наблюдения за их выходом) метиленовым синим прямо в геле. По мере выхода нужных фракций РНК диски DE-81 заменяли свежими. Краситель с дисков смывали этанолом, а РНК элюировали тремя порциями 2 М триэтиламмоний-бикарбонатного буфера (pH 9,5), который потом удаляли лиофилизацией.
В горизонтальном варианте электрофоретической элюции ДНК из геля Табак и Флавелл в качестве сорбента использовали оксиапатит. Фракционирование ДНК вели электрофорезом в пластине 1%-ного геля агарозы в 0,04 М Трис-ацетате (pH 7,7), содержащем 0,02 М CH3COONa, 1 мМ ЭДТА и 0,5 мкг/мл бромистого этидия. По окончании электрофореза под ультрафиолетовым освещением перед каждой флюоресцирующей полосой ДНК со стороны анода скальпелем вырезали канавку шириной 1—2 мм на всю глубину пластины. Канавку заполняли оксиапа-титом, суспендированным в том же буфере, и прикрывали пленкой. Возобновляли электрофорез и вели его до того момента, пока полоски ДНК в параллельном, контрольном треке не продвигались дальше местоположения канавок в рабочих треках. После этого оксиапатит из каждой канавки отбирали пастеровской пипеткой и переносили на маленькую колонку, заполненную сефадексом Г-50. ДНК элюировали из оксиапатита 1 М Na-фос-фатом. Проходя через сефадекс, элюат освобождался от фосфата, и ДНК выходила из колоночки, растворенная в нужном буфере.
Таким образом была получена интактная ДНК с выходом около 80% [Tabak, Flavell, 1978].
В этой же работе описано развитие такого подхода для двумерного электрофореза, позволяющее, например, быстро отыскать фрагмент ДНК, содержащий интересующий исследователя ген, среди тысяч фрагментов, получающихся при обработке какой-либо рестриктазой высокомолекулярной ДНК животных. .Идею метода легко понять из рассмотрения рис. 41.
Сначала в длинную канавку, вырезанную в пластине толстого (20X20X3 см) 0,7%-ного геля агарозы, загружают 5 мг рестрик-тазного гидролизата ДНК в 10 мл горячего буфера, содержащего 0,3% агарозы, которая там и застывает. Размеры канавки 12X0,4 см при глубине 2,6 см. Электрофорез в первом направлении (/) дает сплошную размытую картину — многочисленные рестрикты ДНК расходятся на всю высоту пластины. Затем ведут электрофорез в перпендикулярном направлении (2). В этом направлении с анодного края пластины, в шахматном порядке перекрывая все ее поле, расположены 25 колодцев сечением 2X5 мм и глубиной 2,8 см. Колодцы заполнены оксиапатитом. После электрофореза во втором направлении в течение 24—28 ч при силе тока 250 мА ДНК из каждого противолежащего слоя целиком собирается в соответствующем колодце и сорбируется там на оксиапатит. Его извлекают, и 25 препаратов ДНК одновременно элюируют на колоночках сефадекса, как было описано выше. Затем каждый из 25 препаратов денатурируют и аликвоту его вносят в один из карманов обычной пластины агарозы (или ПААГ), где в 25 параллельных треках идет дальнейшее фракционирование рестриктов ДНК. В каждом треке разделяется свой набор полос теперь уже двукратно фракционированных фрагментов. Эти полосы можно перенести по методу Созерна (см. ниже) на нитроцеллюлозный фильтр и там гибридизовать с меченой мРНК для обнаружения рестрикта, содержащего искомый ген. Этот ген оказывается очищенным в 20—40 раз, что позволяет приступить к его клонированию.
В упрощенном варианте электрофоретической элюции рестриктов ДНК из горизонтальной пластины агарозы в качестве сорбента используют просто фильтровальную бумагу «Whatman ЗММ». Полоску такой бумаги закладывают в щель, вырезанную в пластине рядом с окрашенной бромистым этидием полосой ДНК (со стороны анода). За полоской бумаги в эту же щель закладывают и диализную пленку. Возобновляют электрофорез и ведут его до тех пор, пока ДНК не перейдет в бумагу, контролируя этот процесс под УФ-освещением [Gurvitz et al., 1980]. По существу, в этом случае имеет место не сорбция, а обычная электрофоретическая элюция ДНК в камеру, которая образована толстой фильтровальной бумагой, смоченной буфером. После элюции ДНК с бумаги и промывки диализной мембраны авторы получали 70%-ный выход чистой интактной ДНК. Так же можно элюировать и РНК.
