Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Другой вариант извлечения ДНК из раствора агарозы предложен этими же авторами для препаративных целей. Хорошо известно, что ДНК из концентрированного солевого раствора легко сорбируется на стекле, что вовсе не свойственно агарозе.
Как и в предыдущем случае, гель агарозы растворяют в двойном объеме насыщенного раствора Nal. Растворение ведут в полиэтиленовом флаконе, куда вносят еще и тонкий стеклянный порошок (скорость оседания в воде — не более 2 мм/мин) из расчета 1 г порошка на 1 мг ДНК. Флакон медленно переворачивают в течение 3—4 ч при комнатной температуре. За это время гель растворяется, а ДНК практически полностью сорбируется на стекле. Порошок собирают центрифугированием, отмывают от остатков агарозы 70%-ным раствором Nal и десорбируют ДНК со стекла раствором, содержащим 0,1 М NaCl, 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,2) и 1 мМ ЭДТА в 50%-ном этаноле при 37° в течение 30 мин.
Недавно описан аналогичный подход с использованием сорбции ДНК на стекловолокнистый фильтр GF/C [Chen, Thomas,
1980]. Гель агарозы растворяли в 6 М водном растворе NaCIO*. При комнатной температуре это занимало' несколько минут. Между тем при такой концентрации перхлората натрия ДНК сорбировалась на GF/C полностью (рис. 39)—до 10 мкг на фильтр диаметром 6 мм. Авторы рекомендуют положить фильтр GF/C на лист фильтровальной бумаги и, перенося его каждый раз на сухое место, последовательно наносить в центр фильтра па 100 мкл следующих растворов: промывочного буфера (6 М NaCIO* в 0,01 М Трис-НС1, pH 7,5, с 1 мМ ЭДТА), раствора геля в 6 М NaC104, снова промывочного буфера (10 порций) и, наконец, 10 порций этанола для удаления NaCIO*. После этого ДНК с фильтра элюируют 20 мкл 1 мМ Трис-НС1 (pH 7,5) с 0,1 мМ ЭДТА при 37° в течение 30 мин. Элюат собирают центрифугированием фильтра в микропробирке с отверстием в ее кончике. Выход ДНК достигает 80%. Фаговая ДНК размером 10 КВР остается при этом интактной, а ДНК фага \ (48 КВР) частично деполимеризуется.
Если сохранение полимерности ДНК не обязательно, то после растворения геля агарозы в концентрированном растворе
Рис. 39. Сорбция ДНК (1) и РНК
(2) на стекловолокнистом фильтре GF/C в концентрированных растворах NaCIO* [Chen, Thomas, 1980]
перхлората натрия ДНК можно очищать от агарозы на окси-апатите, как было описано для растворения геля в KI [Humphries et al., 1979].
Расплавление агарозы. Использование описанной в главе 1 легкоплавкой агарозы типа LGT (фирмы «Miles») или «Sea Plaque» («Marine Colloids») позволяет заменить растворение геля его расплавлением при температуре, лежащей ниже точек плавления ДНК или двунитевых участков РНК.
Вислэндер отделял высокомолекулярную мРНК от расплавленной агарозы мягкой обработкой фенолом. Он суспендировал гель агарозы в 5—10 объемах рабочего буфера, расплавлял при 65° в течение 5 мин, добавлял равный объем горячего фенола, насыщенного тем же буфером, перемешивал в течение 15 мин и центрифугировал (12000 g; 10 мин). Водно-фенольная суспензия расслаивалась, агароза уходила в интерфазу, а мРНК оказывалась в водном буфере. После повторной обработки фенолом ее осаждали этанолом. Средний выход мРНК составлял 80%. Повторный электрофорез показал, что молекулы РНК размерами 4S, 18S, 35S и даже 75S оставались при этом неповрежденными. Такой же результат был получен для ДНК полиомы и фага A, [Wieslander, 1979].
Лэнгридж и соавторы недавно описали отделение ДНК от расплавленной агарозы методом двухфазного распределения с участием бутанола [Langridge et al., 1980]. ДНК в расплавленном растворе агарозы обрабатывали 1%-ным раствором цетавлона в водонасыщенном бутаноле при 37е. При этой температуре агароза типа «Sea Plaque» еще не застывает. Цетавлоновая соль ДНК уходила в бутанольную фазу, агароза оставалась в водной фазе. Перевод ДНК в натриевую соль не представляет большого труда.
Аналогичный прием можно использовать и для геля обычной, не легкоплавкой агарозы, в которой электрофорез РНК проводили в присутствии 6 М мочевины. Благодаря мочевине (см. выше) гель обычной агарозы плавится при 75° за 1,5 мин и не застывает даже при 20° в течение 1 ч. Концентрация цетавлона в этом случае несколько выше.
Показано, что бутанол не нарушает трансформирующую способность плазмидной ДНК- Другие биологические свойства нативных ДНК и РНК также остаются без изменений. Однако выход ДНК в бутанольную фазу резко снижается, если ее молекулярная масса превышает 10 млн. Причины этого неясны.
Что касается РНК, то после электрофореза в геле агарозы с добавлением 6 М мочевины всеми другими способами она элюируется очень плохо. Данный же способ дает высокий выход очень чистой РНК, обладающей, например, высокой матричной активностью. Последнее обстоятельство указывает на полноту очистки от агарозы, которая, как известно, ингибирует трансляцию РНК-
Можно расплавить обычную агарозу при 70°, если в геле содержится 50%-ный раствор формамида. Как и в случае мочеви-
ны, формамид способствует разрыву водородных связей, скрепляющих гель агарозы. Естественно, что такие гели используются только для фракционирования денатурированных ДНК.
