Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 69

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 130 >> Следующая

Акридиновый оранжевый в качестве флюоресцентного красителя обладает, по сравнению с бром'истым этидием, рядом недостатков: он дает довольно высокий фон флюоресценции, который
трудно отмывается, а чувствительность окрашивания — на поря-
док нйже [обнаруживает 0,1 мкг ДНК в полосе).
Акридиновый оранжевый
Но у него есть и важное преимущество: окрашивание акридиновым оранжевым позволяет надежно различить полосы дву-нитевых (нативных) и однонитевых (денатурированных) нуклеиновых кислот. Проникая, подобно бромистому этидию, в двуни-тевые участки нуклеиновых кислот, акридиновый оранжевый при освещении ультрафиолетовым светом дает зеленую флюоресценцию (Я,ц.^=530 нм). В то же время электростатическое присоединение этого красителя к однонитевым участкам по остаткам фосфорной кислоты, в отличие от бромистого этидия, приводит к резкому изменению флюоресценции и смещению ее максимума в красную область (Ямке = 640 нм).
Рабочая концентрация акридинового оранжевого при окрашивании гелей 30 мкг/мл (в 0,01 М Ыа-фосфатном буфере, pH 7), а продолжительность окрашивания — около 30 мин. Отмывать фон самого геля можно в том же буфере в течение 2—3 ч при комнатной температуре (лучше в эмалированной кювете, поскольку эмаль сорбирует акридиновый оранжевый, который потом нетрудно отмыть горячей водой). Гель фотографируют при освещении ультрафиолетовым светом (А, = 254 нм) на цветную пленку, например «Polaroid Туре 108 Color film».
Окрашивание РНК нефлюоресцентным красителем метиленовым синим еще недавно использовалось довольно широко, но сейчас почти не употребляется ввиду своей непрочности: после необходимой для удаления фона длительной отмывки окрашенные полосы заметно расплываются. Толуидиновый синий дает лучшие результаты. Его рабочая концентрация — 0,7% в смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1:1:8).
Толуидиновый синий
Окрашивание ведут в течение 16 ч. Отмывают гель в той же смеси, но в пропорции 0,5:1 :8,5, либо за счет дйффузии, либо электрофоретически. Однако фон окраски полностью не отмывается, и в этом отношении предпочтение следует отдать окрашиванию РНК пиронином. Пиронин используется как для окрашивания РНК, так и в качестве лидирующего красителя, поэтому
его структура была приведена выше. Рабочая концентрация пи-ронина при окрашивании РНК 0,5% (в тех же условиях, что и для толуидинового синего). Хорошо прокрашиваются полосы, содержащие 0,3—0,5 мкг РНК [Marcinka, 1972].
ЭЛЮЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ГЕЛЕЙ
Элюция из ПААГ за счет диффузии
Простейший прием элюции нуклеиновых кислот из ПААГ сводится к вымыванию их за счет диффузии в солевых растворах, однако ввиду высокой молекулярной массы нуклеиновых кислот этот процесс занимает много времени. Для его ускорения стараются уменьшить путь диффузии макромолекул из геля в жидкость, т. е. максимально измельчить гель. В неоднократно цитированной классической работе Максама и Гильберт по секвени-рованию ДНК вырезанный из 8%-ного ПААГ участок геля растирали силиконированной стеклянной палочкой в запаянном снизу пластмассовом наконечнике «эппендорфовской» пипетки на 1 мл над слоем стеклянной ваты, затем добавляли 0,6 мл 0,5 М CH,COONH4, содержащего 10 мМ (CH,COO)2Mg, 0,1% ДДС-Na и 0,1 мМ ЭДТА, закрывали наконечник парафильмом и выдерживали 10 ч при 37°. Потом запаянный кончик обрезали и экстракт ДНК выдавливали кратковременным центрифугированием из наконечника пипетки в силиконированную пробирку. Стеклянная вата задерживала в наконечнике частицы геля. Высокая концентрация соли в элюирующем растворе и присутствие ДДС-Na препятствовали агрегации молекул ДНК. ЭДТА и ДДС-Na блокировали остаточную активность нуклеаз.
Иногда для измельчения геля его растирают внутри обычного шприца вращением' его поршня. На дно шприца предварительно кладут плотно прилегающий к стенкам кружок фильтровальной бумаги, через которую затем и продавливают экстракт. Используют и стеклянные гомогенизаторы малого объема. Можно продавливать предварительно измельченный гель через иглу шприца (21-го калибра для 1,8%-ного ПААГ и 16-го — для 7,5%-ного ПААГ).
В элюирующий раствор из указанных соображений иногда вводят до 1 М NaCl. В других случаях, когда нет оснований опасаться агрегации молекул, элюцию ведут при физиологических концентрациях соли или даже в разбавленных буферах. Если сохранение высокой молекулярной массы элюируемой нуклеиновой кислоты не существенно, то имеет смысл измельчить ее молекулы еще в геле, обработав его суспензию ультразвуком. Это заметно ускоряет диффузию и выход нуклеиновой кислоты из геля [Schuercn et al., 1975].
И все же во всех случаях экстракцию за счет диффузии приходится вести длительное время и не на холоду, поэтому следует помнить об опасности деградации (особенно РНК) и принимать
меры по блокированию активности соответствующих нуклеаз. Посуда должна быть хорошо прожарена, буферы — автоклави-рованы. В них нередко вводят ингибиторы нуклеазной активности.
Вместе с нуклеиновыми кислотами из геля неизбежно вымываются примеси белков и короткие нити полиакриламида. Для дальнейшей очистки нуклеиновых кислот используют следующие приемы: фенольную депротеинизацию, переосаждение этанолом или изопропанолом, осаждение РНК 0,2 М СаС1г при pH 5,5—б (Dolja et al., 1977].
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed