Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая несколько более мягкие гели, так что 4%-ный ПААГ в формамиде имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5%-ный водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на основе формамида выше, “ем в обычном ПААГ такой же концентрации.
. Было описано разделение ё аналогичных условиях (8,6% -ный ПАДГ; С= 13) мРНК для а- и [J-цепей глобина кролика [Kaza-zian et al., 1974]. В этих опытах успех разделения зависел от незначительных и не совсем понятных вариаций условий. Например, полосы двух глобиновых мРНК не разделялись, если NaCl добавляли к формамиду не в виде концентрированного водного раствора, а в сухом виде. Подчеркивается необходимость проведения преэлектрофореза.
В другой работе [Marcu et al., 1978] электрофорезом очищали мРНК из плазмацитомы мыши. Использовали 4,1%-ный ПААГ (С=14,5), полимеризованный в 98%-ном формамиде, содержащем 0,02 М Трис-ацетатный буфер (pH 7,2) с 2,5 мМ ЭДТА. Такой же буфер использовали в электродных резервуарах. Электрофорез вели в трубках размером 9,5 X 0,6 см. Преэлектрофо-рез — в течение 30 мин.
Недавно описано разделение электрофорезом на пластинах 6%-ного ПААГ в 98%-ном формамиде фрагментов ДНК, выделенных из мононуклеосом. Окрашивание вели 0,005%-ным раствором «Stains-all» в 50%-ном формамиде в течение 16 ч [Lew et al., 1979].
Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3%-ный денатурирующий гель (С=11) для электрофореза РНК можно готовить на 65%-ном водном формамиде [Bean et al..
1980]. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфэтный буфер, pH 7.
Интересное использование комбинации денатурирующих эффектов формамида и мочевины предложили Фишер и Лерман. По длине ПААГ создавали градиент концентрации формамида (0—40%) и мочевины (0—7 М) и вели электрофорез двунитевых рестриктов ДНК при 60°. Для каждого рестрикта в зависимости от его нуклеотидного состава на градиенте имеется точка, Где происходит частичная денатурация ДНК. Как уже отмечалось, это приводит к резкому замедлению миграции, связанному ? образованием локальных «вздутий» на гладкой молекуле ДНК. Рестрикт образует остро очерченную полосу. Таким образом, Осуществлялось фракционирование по составу рестриктов одинаковой длины [Fischer, Lerman, 1979].
Этот прием был использован авторами работы и в двумерном варианте электрофореза. В первом направлении (пластина 1%-ной агарозы длиной 17 см) рестрикты ДНК разделяли по их размерам. Во втором направлении использовали слабосшитый (С= *2,6) 4%-ный ПААГ, полимеризованный в указанном выше градиенте концентрации денатурирующих агентов. В нем фракционирование рестриктов происходило по нуклеотидному составу. & Качестве буфера в обоих направлениях использовали 0,04 М щис-ацетат (pH 8) с 0,02 М CHjCOONa и 1 мМ ЭДТА. Полоску ЯГарозы из геля первого направления помещали над ПААГ с разором в 2—3 мм и заливали расплавленным раствором 1%-ной
агарозы. Пластина второго направления снаружи омывалась анодным буфером, термостатированным при 60°. На рис. 36 можно видеть, как разделяются близкие по своим размерам рестрикты в простом случае переваривания ДНК фага X рестриктазой Eco RI. Обработка этой же рестриктазой суммарного препарата ДНК Е. coli дает более 250 пятен. Авторы полагают, что разрешающую способность метода можно довести до регистрации 1000 фрагментов (лимитирует разделение в первом направлении).
Локализацию наиболее «легкоплавкого» участка внутри каждого рестрикта ДНК можно осуществить сопоставлением картины расположения в денатурирующем градиенте набора фрагментов, полученных дроблением рестриктной ДНК ультразвуком, с положением целого рестрикта. Длина фрагментов ДНК играет второстепенную роль при электрофорезе в денатурирующем градиенте, и глубина проникновения в гель фрагмента, содержащего наиболее легко денатурирующий участок данного рестрикта, будет практически такой же, как и целого рестрикта. Остальные фрагменты уйдут вперед — дальше по денатурирующему градиенту [Fischer, Lerman, 1980].
Раствор расплавленной агарозы в формамиде при остывании не образует геля. Это легко понять, если вспомнить, что нити агарозы связываются в пучки, образующие пространственную сетку, не ковалентными, а водородными связями; их-то и разрушает формамид.
Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеиновых оснований, давая их метоксипроизводные:
Эта реакция успешно конкурирует с образованием водородных связей по этим же аминогруппам, в результате чего формальдегид является сильным денатурирующим агентом для нуклеиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после денатурации формальдегидом оказываются модифицированными, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при 60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по восстановлению их способности к гибридизации.
Большую опасность представляет возможность образования прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при 3%-ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и сравнительно небольшой загрузке геля (4—5 мкг на трубку) мети-
