Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
- При всем разнообразии этих методов на заключительном этапе всюду применяют электрофорез в ПААГ, полимеризованном в Трис-боратном буфере с добавлением мочевины до 7—8 М. Всем им присуще одно и то же затруднение, возникающее при сопоставлении и расшифровке «лестниц» полос фрагментов. Это затруднение заключается в иногда наблюдающемся аномальном сжатии полос за счет образования при электрофорезе двунитевых структур в областях расположения палиндромов ДНК и шпилек РНК.
Мочевина не всегда может успешно препятствовать образованию двунитевых структур. С этой точки зрения желательно вести электрофорез при более высокой температуре, способствующей их разрушению. Во избежание создания градиентов температуры и искажения полос при этом необходимо улучшить теплоотвод, например путем уменьшения толщины геля до 0,4 мм. Повышение температуры геля обеспечивается просто увеличением начального напряжения до 1500 В на пластину (1300 В после ее разогрева до равновесной температуры). Попутно это еще и значительно ускоряет разделение [Sanger, Coulson, 1978].
С той же целью в методах секвенирования, использующих комплементарный матричный синтез, предложено заменять в инкубационной смеси гуанозинтрифосфат на инозинтрифосфат. Дело в том, что пара И—Ц имеет только две водородные связи, тогда как пара Г—Ц — три. Такая замена сильно ослабляет дву-
нитевые структуры [Mills, Kramer, 1979]. Эти же авторы описывают использование более сильного, чем мочевина, денатурирующего агента при электрофорезе в целях секвенирования ДНК, а именно—90%-ного раствора формамида.
Имеются данные [Lutter, 1979] о том, что разделение полос при секвенировании заметно улучшается, если отношение NN'-метиленбисакриламида к акриламиду в ПААГ увеличить до 1: б (С=14,3). В главе 1 быЛо отмечено, что структура ПААГ при этом становится совсем иной, чем при обычных малых значениях С. По утверждению автора, такие гели легко выявляют различие в один нуклеотид при длине фрагмента ДНК в 160 нуклеотидов. Между прочим Люттер считает авторадиографию не очень надежным методом локализации полос, особенно в случае крупных фрагментов. Он предпочитает отмечать полосы чернилами при ультрафиолетовом освещении окрашенных бромистым этидием гелей, используя способность глаза суммировать эффект окраски по всей ширине полосы.
Электрофорез в 2,8%-ном ПААГ и Na-ацетатном буфере с 7 М мочевиной использовали недавно для очистки вирусной РНК [Both, Air, 1979]. Что касается электрофореза РНК в гелях ага-. розы, то и здесь добавление 7 М мочевины заметно улучшает разделение полос и воспроизводимость результатов. Кроме того, в этих условиях РНК легче переходит на диазобумагу [Locker,
1979] (см. ниже). Агарозу растворяют непродолжительным кипячением в 6 М растворе мочевины, содержащем 15 мМ йодаце-тата, 0,036 М NaH2P04 и 1 мМ ЭДТА (pH 7,4). йодацетат вводят для подавления активности РНКаз в агарозе. Электрофорез ведут при относительно большой для высокомолекулярной РНК напряженности электрического поля (5 В/см) в течение 3—6 ч. Повышение напряженности поля не сказывается на разрешении полос РНК именно благодаря присутствию мочевины.
В заключение отметим, что мочевину нельзя отнести к числу агентов, сильно денатурирующих нуклеиновые кислоты. 6 М мочевина разрушает агрегаты, разворачивает, но не полностью денатурирует РНК, а достаточно комплементарная структура двунитевой ДНК или гибрида ДНК—РНК в ее присутствии сохраняется.
Денатурирующие гели с формамидом
В отличие от мочевины, формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную Структуру полинуклеотидов—как водородные связи, так и «стэ-^инг-взаимодействие» между плоскостями гетероциклических ко-ЛйЦ нуклеиновых оснований. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от Молекулярной массы, что открывает возможность ее определения р Помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.
\
0 12 3 if 5
Подвижность, см2В''1с'1
Рис. 35. Линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы РНК и ее электрофоретической подвижностью при электрофорезе в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в формамиде [Staynov et al., 1972]
1—9 — препараты РНК известной молекулярной массы
Рис. 36. Двумерный электрофорез рестриктов ДНК фага X [Fisher, Lerman, 1979)
Направление J — электрофорез в 1%-ном геле агарозы; направление 2 — электрофорез в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок (0—7 М мочевины и 0—40% формамида)
Стэйнов и соавторы показали, что в сильно сшитом 4,6%-ном ПААГ (С = 13), полимеризованном в 98%-ном формамиде, скорость миграции молекул РНК размером от 5S до 28S связана линейной зависимостью с их молекулярной массой (рис. 35) [Staynov et al., 1972]. Для обеспечения электропроводности в формамид добавляли NaCl до концентрации 0,02 М.
Электрофорез вели в вертикальных пластинах длиной 10 см при толщине 3 мм. На каждый трек вносили по 10 мкг РНК. Напряженность поля— 10 В/см, продолжительное^ разделения 4 ч; гель окрашивали пиронином. Формамид деионизировали, перемешивая в нем катионообменную смолу Dowex 50WX8 20/50 (Н+) в виде 3%-ной суспензии в течение 45 мин (лучше перемешивать с 6%-ной суспензией смолы AG 501X8 в течение 2 ч). Мономеры акриламида и ТЕМЕД (0,2%) растворяли прямо в чистом формамиде. Соль и персульфат аммония (из расчета конечной концентрации 0,12%) растворяли в воде, но в 50-кратной концентрации, чтобы при добавлении этого раствора к формамиду его концентрация оставалась равной 98%.
