Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 60

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 54 55 56 57 58 59 < 60 > 61 62 63 64 65 66 .. 130 >> Следующая

Электрофорез совокупности таких фрагментов в денатурирующем геле (с мочевиной) дает серию полос, своеобразную «лестницу», выявляемую методом авторадиографии. Для четырех разных химических обработок получается четыре различные «лестницы». Электрофорез проводят в параллельных треках на одной пластине геля и сравнивают получающиеся в них картины. «Перекладины» (полосы) одной «лестницы» будут располагаться между полосами других, в соответствии с последовательностью расположения нуклеотидов в нити ДНК. Сопоставляя одновременно все четыре «лестницы» и зная специфику каждого из четырех методов расщепления, можно установить всю последовательность нуклеотидов в ДНК — «прочитать» ее на авторадиографическом снимке геля.
Картина такого разделения показана на рис. 34. Три группы по четыре трека соответствуют трем различным продолжительностям электрофореза. Группа а с наименьшей продолжительностью выявляет последовательность оснований, непосредственно прилегающих к меченому концу нити. При большей длительности электрофореза (б) короткие фрагменты ДНК успевают выйти из геля, зато разделяются и становятся различимы полосы более длинных фрагментов, отвечающие более удаленной от конца нити последовательности оснований. На треках группы а эти полосы были стиснуты в начале геля. То же самое относится к группе треков в по отношению к группе б.
Рис. 34. Секвенирование ДНК по методу Максама и Гилберта (см. текст)
В каждой группе из "четырех треков можно различить в сумме 100—150 полос и расшифровать последовательность нуклеотидов на участке ДНК соответствующей длины. Эти последовательности перекрываются, что позволяет в результате определить непрерывную последовательность длиной в 300—400 мономерных единиц, прилежащих к б'-концу нити ДНК. То же самое можно проделать и для второго ее конца, если радиоактивным фосфором пометить З'-конец нити (методы введения такой метки отработаны) . Выбирая с помощью рестриктаз различные, тоже перекрывающиеся куски ДНК, описанным способом удается секве-нировать участки генома длиной в несколько тысяч нуклеотидов.
Теперь обратимся к специфике соответствующего метода электрофореза. Естественно, что электрофорез коротких фрагментов ведут не в агарозе, а в 20%-ном ПААГ (С=3,2). В качестве буфера геля используют 0,05 М Трис-борат (pH 8,3) с 1 мМ ЭДТА и 7 М мочевиной. Персульфат аммония вносят в концентрации
3 мМ, ТЕМЕД — до концентрации 0,017% (1,5 мМ). Полимеризация геля в пластине 33X43X0,15 см занимает 30 мин. В препараты фрагментов ДНК добавляют мочевину (до 5 М) и по 0,025% лидирующих красителей: бромфенолового синего и кси-ленцианола. Для разрушения возможных агрегатов перед нанесением на гель препараты прогревают в течение 15^р при 90°. Перед электрофорезом гель выдерживают не менее 10 ч. Разделение ведут при температуре 30—40° и напряжении 400—1200 В на пластину. При длине 40 см этому отвечает напряженность поля 10—30 В/см. Для коротких олигонуклеотидов такое высокое значение напряженности поля вполне допустимо, а скорость разделения от этого заметно выигрывает. Бромфеноловый синий мигрирует вместе с фрагментами длиной в 10 нуклеотидов, кси-ленцианол — с фрагментами в 28 нуклеотидов. Электрофорез ведут в течение 36 ч с 12-часовым сдвигом моментов внесения препаратов для трех названных выше групп.
В методе, предложенном примерно в то же время Сейджером и соавторами, использован другой (ферментативный) подход к решению задачи секвенирования-ДНК (Sanger et al., 1977]. Од-нонитевая ДНК здесь выступает в качестве матрицы для синтеза с помощью ДНК-полимеразы I радиоактивно меченной комплементарной нити ДНК. Этот синтез обрывается из-за присутствия в обычной смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов еще и некоторого количества одного из дидезоксирибонуклеозидтри-фосфатов. Включение в синтезируемую нить ДНК такого дефектного нуклеотида делает невозможным ее дальнейшее удлинение. В результате этого синтез обрывается, причем на вполне определенном нуклеотиде, дефектный аналог которого введен в данную реакционную смесь. И опять для множества нитей матричной ДНК получается совокупность всех возможных фрагментов различной длины, радиоактивно меченных и оканчивающихся на одном и том же заранее известном нуклеотиде.
Внося в четыре инкубационные смеси четыре различных ди-дезоксирибонуклеозидтрифосфата, получают группу из четырех наборов соответствующих фрагментов. Денатурацией их отделяют от матричной ДНК, которая в дальнейшем участия не принимает, поскольку нерадиоактивна. С помощью электрофореза, как и в методе Максама и Гилберта, получают четыре «лестницы» полос. При их сопоставлении можно определить нуклеотидную последовательность новосинтезированной комплементарной нити, а тем самым и исходной, секвенируемой нити ДНК.
Легко видеть, что с точки зрения электрофореза ситуация в методе Сейджера оказывается точно такой же, как в методе Максама и Гилберта. То же самое можно сказать и о ряде других методов секвенирования: ДНК по Сенджеру, но с использованием меченного по одному 5'-концу рестрикта и метода «ник-трансляции» [Maat, Smith, 1978]; РНК с использованием химической модификации и гидролиза по модифицированным нуклеотидам [Peattie, 1979]; мРНК с помощью «обратной транскрип-тазы» и модификации более раннего метода Сенджера (« + »- и «—»-реакции) [Brownlee, Cartwright, 1977]; РНК с участием Qfi-репликазы и терминации реакции за счет дезоксирибонук-леозидтрифосфатов [Kramer, Mills, 1978]; РНК с использованием набора специфических рибонуклеаз [Simoncsist et al., 1977]; РНК после неполного гидролиза в горячей воде с последующим введением радиоактивного фосфора на б'-концы получающихся при этом фрагментов [Gupta, Randerath, 1979].
Предыдущая << 1 .. 54 55 56 57 58 59 < 60 > 61 62 63 64 65 66 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed