Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Маркерные молекулы
Во многих случаях электрофореза, описанных ниже, бывает желательно оценить молекулярные размеры (или молекулярную массу) фракционируемых нуклеиновых кислот. Для этой цели удобно иметь набор молекул того же типа, но известной длины. Проведя разделение смеси таких маркеров в отдельном треке пластины геля, можно сопоставить положение полосы исследуемой нуклеиновой кислоты в параллельном треке с расположением полос маркерного набора. Для РНК с этой целью используют тРНК, 5S РНК,, рибосомальные и другие РНК известного размера. Для ДНК роль маркеров выполняет обычно набор фрагментов известной длины, полученных при расщеплении хорошо
изученной ДНК определенными рестриктазами. Таковы, например, наборы рестриктов ДНК фага X, получающихся при переваривании ее рестриктазами Hind III и Eco RI,— порознь и совместно [Murray К., Murray N., 1975].
Лидирующие' красители
В качестве лидирующих красителей при электрофорезе нуклеиновых кислот используют бромфеноловый синий и ксилен-цианол. Следует только иметь в виду, что в крупнопористых гелях агарозы малые фрагменты ДНК могут обгонять даже бромфеноловый синий.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В МЯГКИХ УСЛОВИЯХ
Фракционирование плазмид и фрагментов ДИК
Целые плазмиды можно обнаружить и отделить от ДНК бактерии-хозяина электрофорезом в 0,8%-ном геле агарозы.
Например, Телфорд и соавторы лизировали колонии бактерий, отобранные по устойчивости к определенному антибиотику, обработкой 1%-ным раствором ДДС-Na и протеиназой К при 60° в стандартном Трис-фосфатном буфере (0,036 М Трис+0,03 М NaH2P04+l мМ ЭДТА, pH 7,8), при 50° смешивали лизат с равным объемом расплавленного 0,6%-ного раствора агарозы и наносили на пластину 0,8%-ной агарозы, полимеризованной в том же буфере. Электрофорез вели в течение ночи при напряженности поля 2 В/см. Затем гель окрашивали в течение часа бромистым этидием_(1 мкг/мл). При наблюдении лод ультрафиолетовой лампой наряду с мощной полосой бактериальной ДНК видны полоски неповрежденных сверхскрученных ДНК плазмид, которые уходят вперед (рис. 32). Позади двунитевой линейной ДНК бактерий мигрируют полоски, соответствующие расправленным кольцам плазмидных ДНК (форма II). На одной пластине геля проводили обследование нескольких штаммов бактерий для отыскания в них рекомбинантных плазмид более крупного, чем в норме, размера [Telford et al., 1977].
Для решения такой же задачи другие авторы использовали 1%-ный [Barnes, 1977] и 1,2%-ный гели агарозы [Fantoni et al., 1979]. Очевидно, что концентрацию агарозы можно варьировать в зависимости от ожидаемого размера плазмид. Выбор буфера, как уже указывалось, не играет большой роли.
Рис. 32, Отделение кольцевой (1) и сверхскрученной (5) плазмидных ДНК от основной массы ДНК Е. coli {2) электрофорезом в 0,8%-ном геле агарозы [Telford et al, 1977]
Цифры слева — молекулярные массы маркеров, млн. дальтон
Так, для разделения плазмид и их крупных рестриктов использовали 0,8%-ный гель агарозы, а в некоторых случаях и 3,5%-ный ПААГ, полимеризованные в 0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,5) с 2,5 мМ ЭДТА [Smith et al., 1979]. В таком же буфере, но в 1,4%-ном геле агарозы, разделяли рестрикты ДНК фага X с целью обследования бактериальных экстрактов на наличие в них рестриктаз. Бромистый этидий (1 мкг/мл) вводили в гель еще при его полимеризации [Lui et al., 1979].
Рестрикты ДНК фага SV-40 разделяли электрофорезом в 1,5%-ном геле агарозы (0,04 М Трис-ацетатный буфер, pH 7,9+0,02 М CHsCOONa+l мМ ЭДТА+0,6 мкг/мл бромистого этидия). Агарозу полимеризовали в трубках размером 15X0,6 см, немного суженных на нижнем конце для предотвращения сползания геля. Перед использованием их выдерживали в течение 12 ч на холоду. ДНК (1—Ю мкг) вносили на гель прямо в 25—100 мкл инкубационной смеси с рестриктазами, добавив в эту смесь до 10% сахарозы и до 0,01'-% бромфенолового синего. Электрофорез вели при комнатной температуре и напряжении 60—80 В, т. е. при напряженности поля 4—5 В/см. Для разделения комплементарных нитей отобранных таким образом рестриктов ДНК денатурировали прямо в вырезанных полосках геля, вымачивая нх в 0,3 М NaOH в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем их еще 30 мин держали в 0,015 М NaOH. Наконец, агарозу расплавляли и выливали в трубки на заранее полимеризованную, но уже в буфере низкой ионной силы, 1,4%-ную агарозу. В качестве буфера использовали 6 мМ Трис+7,2 мМ NaH2P04+ +0,2 мМ ЭДТА, pH 7,7. Электрофорез в течение 8 ч вели при напряжении 85 В и температуре 4°. Благодаря низкой температуре и малой ионной силе буфера ренатурации ДНК в ходе электрофореза не происходило [Perlman, Huberman, 1977].
В классической работе Максама и Гилберта по секвенирова-нию ДНК комплементарные нити, полученные в результате предварительной денатурации фрагментов ДНК в 0,3 М NaOH, удавалось полупрепаративно разделять электрофорезом в градиенте концентрации ПААГ (5—10%). Разделение вели в пластинах толщиной 0,3—1 см и шириной 3 см в нейтральном буфере (0,05 М Трис-борат, pH 8,3, с 1 мМ ЭДТА). Исходную концентрацию ДНК, опять-таки во избежание ренатурации, брали небольшой [Maxam, Gilbert, 1977].
