Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Одновременно с белками окрашенный оказывается и сам гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера геля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачиванием его в относительно большом объеме растворителя с не-
сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффузии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто в смеси с метанолом, который улучшает растворимость красителя. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37— 50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опасность ослабления окраски полос. 4
Все типы обычно используемых красителей для белков несут на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-
Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]
мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспендировать немного ионообменной смолы, связывающей краситель и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто используют для этой цели смолу смешанного типа AG 501X8.
Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков минут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле накладывают на гель в поперечном направлении — перпендикулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специальный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электрофореза. Такие приборы («дестейнеры») имеются в продаже, но их легко изготовить и в лаборатории.
Простое устройство для этой цели описано и схематически изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержавеющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смоченного 10%-ным раствором уксусной кислоты» Его помещают в ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюминиевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом. К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфорации в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Через пластину геля размером 12X7X0,3 см нужно пропускать ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15—20 мин. Находящиеся в
осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непродолжительном поперечном электрофорезе остаются на своих местах в геле.
До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Еели в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологической активности, то их локализацию в геле можно осуществить с помощью специфической ферментативной реакции или цепи реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вымачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется, фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и приходится мириться с некоторым размыванием белковых полос. Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффундируют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красителей; и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.
Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миграцией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную, смесь белков можно окрасить красителем «Remazol» [Griffith,
11972], который ковалентно связывается с" белком й "мигрирует вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг белка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCl с 0,2 М Na2HPOt и 10% ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогревают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного красителя белок переосаждают ацетоном.
Чувствительность окрашивания белков многократно увеличивается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных красителей. Многие из них связываются с белками или пептидами, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно использовать для наблюдения за ходом электрофореза после предварительной обработки исходного препарата.
Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные марки красителей и особенности их применения.
Кислые красители
Исторически для окраски белков в геле были прежде всего использованы давно апробированные промышленные красители для шерсти — сложные молекулы с несколькими ароматическими кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодействия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначальное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия суль-фогрупп красителей с положительно заряженными аминокислотными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофобными связями.
Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окрашивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовался при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты
