Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Исходный препарат в такой постановке опыта может быть и не элюатом с колонки, а реакционной смесью, в которой со временем происходят изменения белкового состава, например в результате протеолиза. Маркерные белки с известной молекулярной массой можно прикапывать при заполнении трубки так, что их положение по ее длине будет заведомо определенным.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРИТОНА Х-100 И ЦЕТАВЛОНА
Тритон Х-100
Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, плохо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 зачастую улучшает их растворимость и, ,к тому же, в отличие от мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их биологическая активность.
Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли белки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в 1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с белком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость белка, однако разделение полос оказывается более надежным, если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксировании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, который приходится дольше отмывать.
Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использовать не только для растворения, но и для фракционирования белков. Характер комплекса и количество связавшегося с белком детергента зависят от протяженности гидрофобного участка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на молекулу (родопсин — до 70). Это дает прирост эффективной молекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон (молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.
В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] белки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентрации 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5% р-мсркаитоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в определенной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого процесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и мочевины для данного типа белков подбирают экспериментально. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного ПААГ (С=0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксусной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-ШО. Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-
ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иногда, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содержащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним приходится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внимание следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в электродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кислоту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мочевиной. Возобновляли преэлектрофорез. еще на 45 мин, поменяв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после этого вносили белковые препараты и^ вели электрофорез при постоянном напряжении 100 В в течение суток при той же полярности напряжения (белки мигрируют к катоду).
В рассматриваемой работе удалось наблюдать значительные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-Н и даже мутантов одного штамма. Было использовано и двумерное разделение. Полоски геля после электрофореза в присутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сначала н 1,5 М Трис-HCl (pH 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После этого их переносили на вторую пластину для ступенчатого электрофореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочевины или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.
Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочевиной, удается также хорошо разделять разные формы а- и fj-це-пей глобина- [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатурацию белков в этом случае проводили в присутствии 5% ?-мер-каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять гидрофобные свойства белка.
