Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 34

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 130 >> Следующая

Недавно Ламбен и Файн [Lambin, Fine, 1979]' предложили способ определения молекулярной массы нативных белков (без ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте концентрации ПААГ (3—20%). Оказалось, что для любого белка характер его непрерывно замедляющегося движения в таком
геле хорошо описывается линейной зависимостью: Уt=aD-\-b, где t — любой момент времени с начала электрофореза, пока белок еще движется; D — пройденное им к этому моменту расстояние в геле; а и Ь — постоянные в данном опыте величины.
Для каждого конкретного белка такую зависимость легко получить экспериментально. Удобно, например, в разные карманы одной пластины геля последовательно, через известные промежутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на пластине будет известна продолжительность электрофореза, а расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точкам строят график зависимости у/ от D, имеющий вид прямой линии. Тангенс угла наклона этой прямой—значение коэффициента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффициент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что соотношение между логарифмами коэффициента а и молекулярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный характер в широком интервале молекулярных масс — от 20 до 950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном уравнении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для трех стандартных буферов: фосфатного (pH 7,2), Трис-боратно-го (pH 8,2) и Трис-барбитуратного (pH 9,8). Так, для 0,01 М Na-фосфэтного буфера (pH 7,2) имеет место зависимость: lgAf=l,93 lga+6,99. Точность определения молекулярной массы невысока — в среднем ±20%. Однако важное достоинство метода состоит в возможности оценивать суммарную молекулярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссоциируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя результаты определения молекулярной массы некоего белка описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строение белка.
В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хорош только для разделения белков по размерам. В случае разделения по заряду он может даже ухудшить результат, так как белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же месте.
ДВУМЕРНЫЙ электрофорез в ПААГ
Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда удается осуществить в ходе одного опыта даже с применением описанных выше приемов повышения разрешающей способности электрофореза в ПААГ. Всегда достаточно высока вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввицу совпадения значений их электрофоретических под-
вижностей при выбранном значении pH, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после первого электрофоретического фракционирования смеси белков следует проверить на гомогенность, используя ее как исходный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно сделать одновременно для всех полос первого разделения, или, как его часто называют, «разделения в первом направлении». Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека из пластины первого направления, накладывают на стартовую зону пластины «второго направления». Контакт между двумя гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стартовым буфером или, для надежности, расплавленным раствором агарозы в этом же буфере. Электрофорез ведут в направлении, перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомогенная белковая полоса может дать несколько пятен, если при новых условиях электрофореза подвижности первоначально образовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми. В результате на пластине второго направления после прокрашивания выявляется картина распределенных по всей поверхности пятен, напоминающая «фингерпринт» в двумерной тонкослойной хроматографии. Число пятен, которое удается различить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к двум тысячам (!).
При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно, чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из трубки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщиной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине следует образовать продольно расположенную полость, предпочтительно клиновидного сечения, куда можно" заложить цилиндрик геля и залить его там буфером, агарозой или даже заполиме-ризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образования и форма сечения этой полости не играют большой роли. Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или полоска геля первого направления должны лежать параллельно краю геля в пластине второго направления. Можно, например, воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис. 23). Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для электрофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978а]. Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают плоский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вырезания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии) удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].
Предыдущая << 1 .. 28 29 30 31 32 33 < 34 > 35 36 37 38 39 40 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed