Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно [Murphy et al., 1980] равновесным центрифугированием в градиенте плотности метризамида удалось отделить но-восинтезированный, импульсно меченный хроматин от основной массы хроматина. Новосинтезированный хроматин отличается более высокой плотностью, что, по-видимому, объясняется более плотной упаковкой в нем нуклеосом.
Пример 3. Разделение «тяжелой» и «легкой» нитей ДНК [Russev, Tsanev, 1979]. Меченую ДНК из растущих в присутствии 5-бромдезаксиуриди«а клеток асцита Зрлиха сначала, во избежание спутывания, дробили ультразвуком на фрагменты длиной до 1000 пар оснований. Затем ее денатурировали в 25 мМ NaOH (pH 12,5) в течение 10—20 мин и 0,5 мл такого препарата ДНК смешивали с 4,5 мл 22%-ного раствора метризамида, подщелоченного NaOH до pH 11—11,5. Центрифугирование вели в угловом роторе «Spinco-50 Ti» на скорости 33 000 об/мин при 5° в течение 72 ч. Таким образом, исходная концентрация метризамида составляла примерно 20%, чему отвечает плотность р0= = 1,111 г/см3. Фракции по 0,25 мл нейтрализовали и определяли их радиоактивность. «Легкая» и «тяжелая» ДНК в опыте были помечены соответственно НС- и ®Н-тимидином. Методами регистрации двойной радиоактивной метки были легко выявлены два достаточно хорошо разделившихся пика исходной и новосинте-зированной ДНК, меченной 5-бромдезоксиуридшом. Их плавучие плотности составляли соответственно 1,10 и 1,12 г/см®. При частоте вращения 33 000 об/мин равновесный градиент плотно-
сти метризамида имеет достаточно пологий профиль, чтобы обеспечить уверенное разделение пиков однонитевых ДНК, отличающихся по плавучей плотности всего на 0,02 г/см*.
Глава 7
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ЗОНАЛЬНЫХ РОТОРАХ
В большинстве случаев зональные роторы используют для зо-нально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности раствора сахарозы на стадии препаративного выделения и очистки макромолекул или частиц из большого объема материала.
При подаче в ротор линейного градиента, т. е. раствора, в котором концентрация сахарозы увеличивается пропорционально объему подаваемой жидкости, в нем создается нелинейный — «вогнутый»— градиент концентрации сахарозы («эффект радиального разбавления»). Это легко понять, если мысленно рассмотреть положение внутри зонального ротора двух одинаковых объемов подаваемого линейного градиента сахарозы, из которых один взят из начального, а другой — из конечного участка этого градиента. Каждый из двух одинаковых объемов обусловливает один и тот же прирост концентрации сахарозы (условие линейности подаваемого в ротор градиента). В цилиндрической пробирке бакет-ротора этим одинаковым приростам плотности соответствуют и одинаковые участки длины пробирки, так как сечение ее неизменно. Градиент оказывается линейным по длине, вдоль пути миграции молекул. В зональном же роторе двум одинаковым объемам соответствуют цилиндрические слои разной толщины: большей близ центра и меньшей у его периферии. Это означает, что один и тот же прирост концентрации сахарозы будет растянут во внутренней зоне градиента и сжат вблизи наружной стенки ротора. Иначе говоря, градиент плотности будет характеризоваться увеличением крутизны своего профиля при переходе от внутренней зоны к периферической, т. е. будет вогнутым. В целях получения более близкого к линейному профиля градиента в ротор подают иногда не линейный, а выпуклый (например, экспоненциальный) градиент сахарозы (см. выше).
Так, для препаративного разделения рибосомных субъединиц в зональный ротор Ti-15 подавали экспоненциальный градиент сахарозы [Sypherd, Wireman, 1974]. В смесителе постоянного объема (700 мл) находился раствор сахарозы с концентрацией 7,4%, а в резервуаре —50%-ный раствор. Объем градиента был небольшим (всего 700 мл), что обеспечивало в роторе диапазон концентраций 7,4—38%. Вместе с подушкой из 45%-ной сахарозы градиент занимал лишь половину объема ротора — слой в
3 см, прилегающий к наружной стенке. Центральная зона ротора была заполнена буфером. Незначительная выпуклость градиеи-
та (VCM=Vrp) компенсировала не очень сильное радиальное разбавление в периферическом слое жидкости. Естественно, что препарат рибосом (2 мг) в этом случае тоже вносили со стороны стенки ротора (в 100 мл О—5%-ного градиента сахарозы) перед введением градиента, когда ротор был заполнен буфером без сахарозы. Затем подслаивали градиент сахарозы и «подушку», ко^ торые оттесняли препарат к центру ротора. Такой способ внесения препарата дает лучшее качество фракционирования, чем наслоение препарата на градиент через центральный канал ротора с последующим введением тем же путем еще и буфера.
Центрифугирование вели при скорости 35 ООО об/мин в течение 5,5 ч. Разделение 30S-H 50S субъединиц было очень хорошим. Элюцию вели через центральный канал подкачкой 60%-ного раствора сахарозы на периферию ротора. ->
Экспоненциальный градиент раствора сахарозы (6—30%) в 5 м(М Трис-НС1 (pH 7) с 1 мМ ЭДТА и 20 мМ КС1 был использован и для препаративного разделения моно-, ди-, три- и тетра-нуклеосом из хроматина зародышей цыпленка [Wittig В., Wit-tig S., 1977]. В этом случае ротор Ti-14 был заполнен градиентом сахарозы почти полностью: 600 мл градиента, 30 мл раствора препарата (600 мг ДНК) и 20 мл буфера над ним. Центрифугирование вели при частоте 45 000 об/мин и температуре 1° в течение 21 ч. Попутно отметим, что хорошего разделения олигомеров нуклеосом удавалось добиться только в том случае, когда после обработки стафилококковой нуклеазой хроматин дополнительно переваривали рибонуклеазой и переосаждали 5 мМ MgCl*. В противном случае вблизи мениска и в зоне моно-, ди-и тринуклеосом оказывалось большое количество постороннего материала, маскирующего картину разделения олигонуклеосом.
