Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 108

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 130 >> Следующая

При обычном выделении получают нативную ДНК с интервалом значений s20.«. 10—30S. Ориентировочно режимы центрифугирования в этом случае можно принять такими же, как при фракционировании РНК рибосомных субъединиц: градиент 5— 20% сахарозы, температура 20°, время центрифугирования
5—6 ч при 40 тыс. об/мин и 11 —13 ч — при 27 тыс. об/мин. Это время указано для линейной двунитевой ДНК. Кольцевая двуни-тевая ДНК в виде свободного кольца (с разрывом в одной из нитей) оседает быстрее, чем линейная. Еще быстрее оседает кольцевая сверхскрученная ДНК в присутствии высокой концентрации соли (~ 1 М NaCl).
J *
i!
53 ^
I ^
CS <
I5
Щелочной градиент сахарозы используют для денатурации ДНК, обнаружения скрытых разрывов, оценки истинных размеров «развернутой» молекулы ДНК. При pH 12,1—12,3 линейные молекулы ДНК денатурируют, а плазмиды сохраняют свою двунитевую кольцевую структуру. Щелочные градиенты обычно получают, растворяя сахарозу в 0,1—0,3 М NaiOH с 0,7—
0,9 М NaCl. В этих условиях денатурируют любые двунитевые структуры. Сверхскрученные ДНК могут сохранить нативность
в 0,1 М NaOH, если концентрацию соли снизить до 0,15 М. По-видимому, соль при высокой концентрации вызывает диссоциацию от ДНК остаточых белков, скрепляющих двунитевую структуру.
Для щелочных градиентов нежелательно присутствие ионов
_______________________ Mg2+, Са2+ и Р043- : Mg выпада-
о го to во ет в осадок в виде Mg (ОН) 2 и за-Козффициент седиментации, S хватывает ДНК, Са2+ И РО*3~
взаимодействуют с ДНК, замет-Рис. 61. Обнаружение фрагментов но увеличивая ее константу седи-
Оказаки центрифугированием в ментации. Ввиду этого в щелоч-
растворГ сахарозы Tokazaki* ные градиенты, как правило, вво-
раствора сахарозы LUkazaki, дят ,_5 мМ ЭДХА
Чаще всего используют градиент 5—20% сахарозы. Скорость и время центрифугирования зависят от полимерности ДНК.
Пример 8. Очистка бактериальной ДНК [Rupp, Howard-Flanders, 1971]. Протопласты бактерий наслаивают прямо на щелочной градиент 5—20% сахарозы, растворенной в 0,3 М NaOH с 0,7 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Происходит лизис, свободная от белка бактериальная ДНК денатурирует и быстро оседает. В роторе SW 50.1 при 40 тыс. об/мин и 20° центрифугирования длится 1 ч.
Легко подсчитать, что ДНК с s2o,w= 100S пройдет за это время около 3 см по пробирке длиной 5,1 см.
Для ДНК с константой седиментации около 20S (ДНК ФХ174, SV=40 и др.) режимы центрифугирования примерно такие же, как в нейтральном градиенте: 12—15 ч при 25—
27 тыс. об/мин и температуре 20° й 18—24 ч — при 5°. При 40 тыс. об/мин продолжительность центрифугирования соответственно уменьшается.
Пример 9. Обнаружение фрагментов Оказаки [Okazaki, 1971]. Бактерии получали импульсную метку *Н-тимидином продолжительностью от 2 с до 2 мин. Анализ размеров новосин-тезированной (меченой) ДНК проводили центрифугированием в щелочном градиенте 5—20% сахарозы в 0,1 М NaOH с 0,9 М NaCl и 1 мМ ЭДТА; ротор SW 27.1. При 25 тыс. об/мин и 4е
центрифугирование длилось 16 ч. Как видно из рис. 61, на градиент хорошо укладывались как пик фрагментов Оказаки (s2o»a>== 10S), так и зрелая ДНК, фрагментированная в широком диапазоне (20—60S).
Пример 10. Малые фрагменты ДНК после переваривания ДНКазой I [Hell et al., 1972]. Разделение проводили в очень пологом щелочном градиенте 5—10% сахарозы центрифугированием в бакет-роторе MSE (6Х 14 мл) при 24,5 тыс. об/мин и 20° в течение 36,5 ч. Молекулярную массу фрагментов рассчитывали, используя соотношение: s2о,о = 0,0528 Ж0-4. Для нейтральных градиентов и нативной ДНК соответствующая зависимость [Studier, 1965] имеет вид: s2o,» = 0,0882 Л!0-3*6.
* * *
В заключение еще раз отметим, что выбор режима зонально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности растворов сахарозы достаточно свободен. Изменение продолжительности центрифугирования на ±20%, как правило, не очень сильно меняет характер фракционирования. Важно лишь правильно оценить соотношение значений разделяемых компонентов в препарате, диктующее выбор крутизны градиента сахарозы. Затем для максимально допустимой скорости имеющегося в распоряжении бакет-ротора (с длинными пробирками) с помощью номограмм следует найти ориентировочную продолжительность центрифугирования. Ее можно затем уточнить после первого пробного опыта.
Если нет необходимости центрифугировать на холоду, следует предпочесть работу при 20°. Качество разделения от этого практически не страдает, так как усиление диффузии компенсируется сокращением продолжительности опыта. Между тем расход рабочего ресурса центрифуги уменьшается почти вдвое.
В начале главы были указаны причины относительно редкого использования глицерина для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его недостатком является более высокая вязкость растворов по сравнению с растворами сахарозы той же плотности. Однако недавно повышенная вязкость концентрированных растворов глицерина была использована для фракционирования относительно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6— 76% (по объему) глицерина при 130 000 g в течение 16 ч. Профиль олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно распределялся по этому градиенту [Rennie, 1979].
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed